PROEFSTATION VOOR TUINBOUW ONDER GLAS TE NAALDWIJK
Vegetatieve vermeerdering van Asparagus Setaceus (Plumosis) in vitro.
Proef XIV: Invloed van Cortisonen in het medium op de wortelvorming.
Ph.E. de Vreede
Inhoud 1. Inleiding. 2. Proefopzet. 3. Resultaten. 3.1. Verontreinigingen. 3.2. Scheutvorming. 3.3. Wortelvorming. 3.4. Verkleuring. 4. Discussie. 5. Conclusie.
Vegetatieve vermeerdering van Asparagus setaceus (plumosis) in vitro.
Proef XIV Invloed van Cortisonen in het medium op de wortelvorming.
Tijd December 1981 - januari 1983.
Project C4.
Uitvoering Phi lomeen de Vreede. Proefneemster : Wil van Ravestijn
1 Inleiding.
In deze proef wordt de invloed van Cortisonen in het medium op de wortel vorming nagegaan.
In de vorige proef (proef XIII) werden de Cortisonen toegediend door ranken een bepaalde tijd in een cortisonoplossing te plaatsen en vervolgens werden de explantaten op een wortelinducerend medium uitgeplant. In die proef (XIII) trad zeer veel verontreiniging op.
In proef XIV worden de Cortisonen aan het medium toegevoegd om minder
verontreinigingen te krijgen en daardoor meer kans op wortelvorming te creëren. Cortisonen zijn groeistoffen, die de wortelgroei induceren en de groei bij planten bevorderen; ze hebben soms cytokinine (inductie celdeling), soms een auxine (inductie celstrekking)-achtige werking.
Cortisonen moeten koud worden gesteriliseerd en worden dan ook d.m.v. filtratie met een millipore-filter aan het medium toegevoegd.
Explantaten zijn genomen van donkergroene veren.
Per behandeling wordt één tak snijgroen gebruikt, waarvan de onderste doorn steeds 1 en de bovenste steeds 10 wordt genoemd.
De 5 onderste doornknoppen van een tak worden aangeduid als de "oudere" explantaten 1 t/m 5, waarvan 1 de "oudste" is. De 5 doornknoppen daarboven
worden aangeduid als de "jongere" explantaten 6 t/m 10, waarvan 10 de "jongste" is. 2. Proefopzet.
2
-Er wordt één basis-medium gebruikt, hieraan wordt geen of 10, 20, 40 of 80 mg/1 hydrocortison , dihydrocortison of tetracortison toegevoegd.
Deze stoffen moeten koud worden gesteriliseerd i.v.m. instabiliteit voor hoge temperatuur d.m.v. filtratie met een millipore-filter. De volgende
behandelingen worden vergeleken.
Concentratie in mg/1 0 0 + dmf* 10 20 40 80 Hydrocortison 1 2 3 4 5 6 Dihydrocortison 7 8 9 10 Tetrahydrocortison 11 12 13 14 £
dmf: zie oplossing Cortisonen.
Het basis-medium bestaat uit:
Murashige and Skoog (M + S) van Flow (halve sterkte) cat.no. HCM 101 zouten 2 FS - 112
Fructose IAA
om te stollen Bacto agar
Voor dit medium wordt "Pyrex"-gedestilleerd water gebruikt en de pH wordt gesteld op + 5,6.
Dit basis-medium wordt in porties van 250 ml^ (= één behandeling) erlenmeyers gesteriliseerd 15 minuten op 121 C (= 1 atm.).
Het oplossen van IAA is als volgt: 100 mg. IAA wordt opgelost in 3 ml. NaOH ln en daarna aangevuld tot 100 ml. met "Pyretf'-water.
Dit is 1000 dpm (= 1000 mg)1).
Het toevoegen van de Cortisonen aan het medium gaat als volgt: 40 mg. Cortison wordt opgelost in 1 ml. dimethylformamide (dmf) en
vervolgens aangevuld tot 10 ml. met water. Per erlenmeyer met 250 ml. vloeibare maar al enigszins afgekoelde steriele voedingsbodem worden de volgende
hoeveelheden van Cortison via het millipore-filter gepipetteerd: 5 ml. bij
behandeling 6, 10 en 14; 2,5 ml. bij beh. 5,9 en 13; 1,25 ml. bij beh. 4,8 en 12; 0,63 ml. bij beh. 3,7 en 11, steeds respectievelijk hydrocortison, dihydrocortison en tetrahydrocortison. Bij beh. 2 wordt de hoogste concentratie dimethylformamide toegevoegd, dit is een 2% dmf oplossing en dit is dezelfde concentratie als bij beh. 6, 10 en 14.
2,33 g/1 30 g/1 0 ,01 mg/1 8 g/i
3
-De explantaten zijn ontsmet door ze even in de alcohol 70% te dopen en daarna 10 minuten te ontsmetten in een 1% chlooroplossing. Deze chlooroplossing bestond uit chloorbleekloog + 0,1% uitvloeier. Het ontsmetten werd gevolgd door 3x steriel spoelen.
Voor het planten zijn de explantaten gedroogd m.b.v. steriel filtreerpapier. Vervolgens werden de explantaten polair geplant (doorn wijst naar beneden) en zijn de buizen afgesloten mgt aluminium doppen en parafilm. De kweken zijn in het licht (16 u/dag) bij 27 C geplaatst.
De gegevens betreffende de bereiding en het uitplanten zijn in bijlage 1 opgenomen. De gemiddelde temperatuur van Vötschkast III geeft bijlage 2 weer.
3. Resultaten. (Zie bijlage 3).
3.1. Verontreinigingen.
Van alle explantaten is 35% verontreinigd na gemiddeld 99 dagen met een spreiding van 7 tot 232 dagen.
Bij onbehandeld (= zonder Cortisonen in het medium) trad 10% verontreiniging
op na 42 dagen.
Bij de toevoeging van een 2% dmf-oplossing aan het medium (= beh. 2) trad 100% verontreiniging op na gemiddeld 122 dagen. De verschillende cortison-toevoegingen aan het medium, namelijk hydro-, dihydro- en tetrahydrocortison gaven respectievelijk 48, 13 en 35% verontreiniging na gemiddeld 108, 44 en 96 dagen.
De verschillende concentraties Cortison geen (= onbehandeld) 10, 20, 40 of
80 mg/1 gaven respectievelijk 10, 20, 30, 37 en 40% verontreiniging na gemiddeld 42, 48, 90, 110 en 109 dagen.
De "jongere" explantaten 6 t/m 10 geven iets minder verontreiniging, namelijk 33% t.o.v. de "oudere" explantaten 1 t/m 5 37% verontreiniging. De duur tot de verontreiniging is ongeveer gelijk gemiddeld na 100 dagen.
3.2. Scheutvorming. (Zie bijlage 3a en 3b).
Van de niet binnen 14 dagen verontreinigde explantaten heeft 79% hoofdscheuten gevormd gemiddeld na 14 dagen met uitersten tussen 7 en 77 dagen.
Bij onbehandeld heeft 90% scheuten gevormd na gemiddeld 15 dagen.
Bij de behandeling met toevoeging van een 2% concentratie dmf zijn 8 0% scheuten gevormd ook gemiddeld na 15 dagen.
De hydro-, dihydro- en tetrahydrocortison-toevoegingen aan de media geven respectievelijk 72, 82 en 81% scheutvorming na gemiddeld 15, 14 en 12 dagen. De verschillende concentraties Cortisonen, namelijk: geen (onbehandeld) 10, 20, 40 of 80 mg/1 geven respectievelijk 90, 75, 78, 79 en 81% scheut vorming na gemiddeld 15, 14, 10, 16 en 12 dagen.
De "jongere" explantaten 6 t/m 10 geven meer scheutvorming, namelijk 84% t.o.v. de "oudere" explantaten 1 t/m 5 75% scheutvorming. De duur tot scheutvorming
4
-Van de niet binnen een maand verontreinigde explantaten trad bij 44% zij scheut vorming opk gemiddeld na 38 dagen. Dit komt overeen met 52% zij scheutvorming t.o.v. explantaten, die al een hoofdscheut hebben.
Bij onbehandeld trad 50% zij scheutvorming op, gemiddeld na 42 dagen.
De toevoegingen hydro-, dihydro- en tetrahydrocortison hebben respectievelijk 52, 31 en 47% zij scheutvorming gegeven na gemiddeld 35, 30 en 47 dagen.
Bij de verschillende concentraties Cortison: geen (onbehandeld) 10,20, 40 en 80 mg/1
trad voor de respectievelijke concentraties 50, 31, 56, 35 en 50% zijscheut-vorming op na gemiddeld 42, 44, 36, 35 en 39 dagen.
Bij de "jongere" explantaten trad meer zij scheutvorming op namelijk 49% t.o.v. 39% bij de oudere explantaten. De duur tot deze zij scheutvorming is weer gelijk + 38 dagen.
3.3. Wortelvorming.
Van de niet binnen 4 maanden verontreinigde explantaten heeft bij 2,2% wortel inductie en uitgroei plaatsgevonden. Deze wortelvorming vond plaats bij
2 explantaten na 183 dagen, namelijk bij onbehandeld, d.w.z. geen
cortison-toevoeging aan het medium en bij een cortison-toevoeging van 20 mg/1 hydrocortison aan het medium. Beide explantaten zijn "jongere" explantaten van de veren geweest.
Nadat de scheuten en wortels goed gegroeid waren, zijn de explantaten uitgeplant in grond op de gebruikelijke wijze (zie intern verslag no. 24, 1984, blz. 8).
3.4. Verkleuring.
Alles wat niet verontreinigd is of geen wortels heeft gevormd, is na verloop van tijd afgestorven (verkleurd).
Gemiddeld is na 193 dagen alles verkleurd wet een spreiding van 28 tot 380 dagen.
4. Discussie.
De behandelingen, waarbij Cortisonen (beh. 3 t/m 14) of dmf (beh. 2) aan het medium zijn toegevoegd, hebben gemiddeld meer verontreinigingen dan onbehandeld. De vermoedelijke oorzaak van de verontreinigingen is de wijze, waarop de stoffen aan het medium zijn toegevoegd. Bij een volgende proef zal worden getracht de stoffen beter gesteriliseerd te krijgen door een juister (preciezer, schoner?) gebruik te maken van het millipore-filter.
Bij de behandelingen met cortison-toevoegingen is de procentuele groei van hoofd- en zijscheuten niet bevorderd t.o.v. onbehandeld, zoals verwacht werd. Namelijk Cortisonen zouden groei induceren.
Wel is de duur tot de scheutvorming met cortison-toevoegingen gemiddeld sneller dan zonder Cortison in het medium.
Om meer effect van Cortisonen te krijgen zal eerst de toedieningswij ze van deze
Conclusie.
Welk Cortison als beste reageert wordt uit deze proef niet duidelijk.
Dihydrocortison heeft de minste verontreiniging gegeven, dihydrocortison en tetrahydrocortison de meeste hoofdscheutvorming, hydro- en
tetrahydro-cortison de meeste zij scheutvorming en alleen bij hydrocortison zijn bij één explantaat wortels gevormd.
Er is geen bepaalde concentratie Cortison, die duidelijk beter is t.o.v. de andere concentraties.
De scheutvorming is sneller na toevoeging van Cortisonen aan het medium, maar scheutvorming is niet het struikelblok bij de vegetatieve vermeerdering van snijgroen.
Bij lage 1.
08121981 14 kolven media gemaakt en geautoclaveerd.
Filters en millipore-filters los van elkaar gesteriliseerd in aluminiumfolie.
09121981 Behandeling 1 in buizen gegoten (+ 15 ml. per buis).
Behandeling 2 dimethylformamide toegevoegd en in buizen gegoten. Behandeling 3 t/m 6 hydrocortisonoplossing toegevoegd en in buizen gegoten.
10121981 Behandeling 11 t/m 14 tetrahydrocortisonoplossing toegevoegd en in buizen gegoten.
22121981 Behandeling 1 t/m 6 en 11 t/m 14 geplant en geplaatst in Vötschkast III.
29121981 Behandeling 7 t/m 10 dihydrocortisonoplossing toegevoegd en in buizen gegoten.
Bijlage 2.
Gemiddelde temperatuur per decade in °C.
jaar maand decade max. min. 9 u. 14 u
1981 dec. 3 27.8 26.8 27.5 27.8 1982 jan. 1 28.0 25.5 26.8 27.4 I t II 2 27.2 24.5 26.7 26.9 II II 3 -- - -t ! febr. 1 - - - -II II 2 - - - -II II 3 28,8 20,9 28,1 28 ,5 II mrt. 1 28,8 21,1 25,6 28 ,0 I I II 2 30,3 23,8 30,0 30,1 t l II 3 30,8 24,1 30,2 30,4 II apr. 1 30,6 24 ,7 30,4 30,4 II l i 2 31,3 24,5 30,0 30,5 II M 3 30,7 23,7 30,3 30,5 II mei 1 30,2 23 ,2 30,0 30 ,0 II t l 2 29,5 20,8 28,9 28,7 II H 3 27,9 21,7 27,3 27,7 II juni 1 28,1 20,1 27,9 27,5 II i t 2 27,7 19,4 27,3 27,3 II » 3 28,1 19,7 ' 27,9 27,3 II juli 1 28,1 19,6 27,7 27,7 I t II 2 28,3 20,2 27,9 28 ,0 t l II 3 29,4 21,2 29,1 29,1 II aug. 1 29,0 20,7 28,6 28,4 II H 2 28,7 20,3 28,4 28,2 II i t 3 28,4 20,2 28,2 28,2 II sept. 1 28,2 20,1 27,8 28 ,0 I I I I 2 29,0 20,9 28 ,4 28,6 t l II 3 28,7 •21, 0 28 ,4 28,6 II okt. 1 28 ,8 20,8 27,5 28,8 I I I I 2 28,9 22,2 28 ,8 28,8 I I II 3 28,8 21,2 28,6 28,7
2
-jaar maand decade max. min. 9 u. 14 u
1982 nov. 1 28,6 21,2 28,5 28,5 H Il 2 29,1 21,5 28,9 29,1 fi II 3 28,7 21,4 28,6 28 ,6 f! dec. 1 25,7 25,3 25,7 25,5 Il Il 2 19,6 17,5 18,2 18,4 n II 3 21,8 19,6 19,2 20,1 1983 jan. 1 20,2 19,8 19,9 19 ,9 II n 2 20,2 19,7 19,8 19,8 II il 3 20,2 19,8 19,9 19 ,9
? O
£
«
• £ c V E c c t m m CD l ® » » ® B « » i N m m < M m « ^ * * m i r t m m w t t m i n m i N i r t m «M m * « 4 fM ^ e * CD * t m r * « N f < f » < © , i A > n ® »ri œ c e m r * r * C w C 5 . t i - i E ^ je C w r c-e > « a < c 1 e — W C t f t GO J f « r o i c n » t n g j t f h H < r 9 > o m t e i ® ^ ® o * m « e , r » i N ® ^ o rs r* «4 «- »« -« m «* *- H H H H f N r t l N N H N « « N ^ &. <& r » © C w C 5 . t i - i E ^ je C w r c-e > « a < c 1 e — W C t f t GO J f . O O O O c e œ ^ ' N * £ t t e r . » -<» -,' ' - * r - r » < N e \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ w 1 tfp*, «r — N t t ^ « B O « f f i N N h N p^-^ (N rs w ** ** ry rs »4 r«. © O © © * ifl ^ \ S \ \ \ \ \ \ \ \ S \ N n ® i n « r » © m » r » * c « r © ^ (DVNBlAlCin<rp<0 C\ <D t* Œ ^ ^ r - e > r » r * c e > c o o o o o o o o o o o o s o œ o o o o o c o o o c e s ^ © o © © o o e < c D O O o « e o o o o o o c c e c O o © o c * 6 F — » c * f t — *- W C C 01 f t > © * O O O r - ^ r ^ c N — ^ N \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ S œ o e c « » < N \ c « f f > o o c r ~ r - f s »w ^ C5 © O © © V f- »W » «» c \ \ s s \ \ \ \ \ \ \ \ \ 0 \ 9 > © f l D © 0 © f * > 0 0 V i n o •M m -H —t ^ w œ K « E »-> C -fc» p - c H * r i n CS 1 1 CD 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 O ^ mm r-i <C 1 1 t t 1 1 1 1 1 1 i t 1 1 » n m m m 1 1 1 1 1 i a> ® 1 l i œ e e m m m m 1 1 1 1 1 1 œ s 1 f i s © « 0 • c > - E m f t f t ' c *J er. m c c 1 1 CD 1 1 1 1 1 1 1 ( ) 1 m m œ i i t t i i œ œ i i l œ © m m m m C 0 1 e î r < ft> " t c w c t ' f t C Ä " V . I I \ l l l l l | I i 1 l \ m w -M ^ IN IN » 1 1 1 1 1 "V. "S. 1 1 m m 1\*S. ^ ® ® m m m t c -<N — C O C O O O O O O O O O O r s — IM m «n © © © © © O ^ m © © © • » * > » ft» — *» E w u ( c O» 0 0 f t ) -» > w c ê i o e o w o « » i n < N % c \ D o > ' - « - H ^ r ^ r - f N \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ " H O O m O O O O O O O O O O < N © © © © * r» — 0 * 0 » » " * 0 5 © ^ 0 ® ^ m V V O \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ © o © o © O m < - i © © © r « j « N o -r c c — « — E E w *• © i c m c ^ o u ^ c m c t c ? ' " " . © O C f " fN t n ^ f s ' v c r ^ c m m f n m m o m t-- T f ' V C t f œ C N i r t " . c * <N u - m m :> > *• • S C1 ] 1 3 0 t ' £ * * — c ! X? «•» +s L.' V K c ! c ^ c D r - i r e o w v c e c e B a c c e c r ^ f ' ^ — •m >— c ; ir m (Nm^cscrsmmm*®©^ ^ - 8 = = ! t © < ^ i N © r \ m ^ - . œ \ c © OC'O — *r L1^ »H: ^ - v r ^ - s c ^ - r ^ c c i n L i t r IN m L", x c *> CT E \ c < N ^ u i f N o i » n u ' i » N i / " i * e \ c i > £ \ c ® œ v e v c r > j r N f N ^ c i ^ , f N v c \ c t c \ c w ^*œiTi cr «e ce " * 1 c C w . . t ' C £ Cn > r M m m r v f > i f s < N f s c s r « # - ) J N C C I < N v r \ i n i / ^ — B m m o j f N f s i N i N f s i N r » r s r s f s H ( t B B 1 £ «•» i-H t E •H X C ^ C--t f S c f N O V T r - , f N c s m c E — c 1 W. T * " i * j f s m f > r-i f N n " ) C N i t n « « r 4A c e m © e u ^ L ' - ^ u - i P ^ i r . L n m ©•• ^ ^ m m m m m m v ^ m m m c Œ.-C - m « —1 p . < * I C « — w C t» f t -c .* i n i n c u f n i A * e « N f - » » » ) < N ^ e e * I n \ N \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 1 \ \ © © » v r n d i c r - ï v e o v m c s i ^ o-, • H c D œ c v e D C i ^ œ o N i T i o f J «-i o « N W < N m O è ^ * © <N « N f s m \ \ \ \ \ \ N \ \ \ \ \ \ ^ o e O ^ i T i O O x e m * £ m o -*c©«p-^iN-vmvfs© rs- r- «r, « — i r N iIH f N - - r N r S r - i f N C N " C \ C O •*-> » 3 & O t f f N m i n r ^ W f n o O o w o r - i r . L - i f N * r - v c r s i r - i r ^ r - , * T C D m ^ < • m « > m © m ® r ^ < N ® < N o © » ^ m ^ m t n m i f t i c ^ m * m * * x - r » U E I C t t W f t ) — -r*> 0 wc —< > C f t , M Q J f » • ' 0 » o < r ' " œ © * r " » e r \ « H r t « — ! ® \ C D r » \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ 4 n t ^ « N r - l * C W 5 < N f - * m f » ) ^ « D O V O O O O S \ ^ * n f N m r s c N < N f N n f N m « N « - i - H C S \ \ \ \ S \ \ \ \ S \ v © « r <n m ift \ \ X e E H O i T i v f v œ ^ H r H v ' r i n r~-r v r~-r ^ r~-r ) m r~-r - m « N ( N < N » - i < N m ^ f - ) r - i N m < — . — i i N m f \ p - f N f s i m r - r * t n r * r ^ 0 ^ O -c -5 e f c ü E »H « 0 '" 3 S C O t rr. ^1. ^ mm ^ m-, Z, v i n © ^ v m f s f ~ * m m m ^ v c u C C 0s < ft' — 1 c W C O f t ' c «* N N \ \ \ \ \ \ \ \ \ v x s \ r n o r - ^ v e m e r . -H — m m © f s ^ n m i N t n r » -® O -® 0 D O * " < m m m ^ t v i n o \ " \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ r s i m r ^ v v c œ o m r ^ r * ' ^ m r » œ c N v t < - n © ' v v m © « - < •—ii—i ^ r n ^ r v m « - ) m r - m * 1 c © o o m o v f - ^ i o c o o c o t t . c ^ e r - ^ c D ^ r - e c e D o i c o c D r - o O N r-. i f î v o m 4 f > o r * ^ p i r > f c n u i * o r ^ i f t f ' © © © ^ © ® © p - © ^ 3 — ft- E I C O» X w f t t V 0 W C 10 > f c > C' e jt. © O O O o O o © r n © f ^ v m r v m * m « » m m * r ^ m M5 *c m \ s \ \ M ^ ^ v t n o X IC • e r-i fN M IN -H fH JQj f N r w f s m m s c m i N m ® « N © © m m m ® ® ® ® " ® ^ m » n m (V (N (V H H H N H fS MMN 4J — C c C C -w ft) — E i N ^ H ^ r - r ^ r - r » . - * i i 1 « r ^ fN ^ <N ** <-« ^ •«, f s m « —< • 0 c • H J J C r g 0 1 f N < N v c — < r « ' o e o \ ' H 1 1 i m e o o . m , • « r f N ^ r - n f s v f s ^ pH " ' » » n o , ^ f N ^ o O Ä ^ O ' H r » ^ s £ . m o i N j f N m ® ® * ^ * © * © ^ © o o p-< »H •-< ^ C W e f t » pv < > I C t » — w e SS ^ S i N i D » » * ^ n « ® ^ \ N \ \ S S S \N O H « m n r > H 1 1 1 ^ » • ^ * ^ V « N ^(Noitnvi^otiN *N m © » n ^ r»> CD ^ w * r î î S ^ N \ \ \ \ \ \ v v v v ^ w « n r i O f t — # u — ai—as——-1 m* * o o o o o o o e o o o o o o m f> œ •*> m * o * c o ^ m o s o m o o m m r s ^ ^ f N m ^ f N f N m m m H O* c c I C 9 0 -« • w 9 1 w C 41 — C • > c a je o o o o e o o o o o o o o o o * \ S \ \ \ N S S \ \ N \ N \ N » H O f N i r » ® * " » ' H O © o m n œ r i < * » © ' s C s S N N N S N N . S N N s © m o (N IN v 0 c « 4 < N f * > v i r t v o r *Kc o 0 « o ^r s , r^ v •s ^ f N m * k n s c f » ® ^ 0 m © É E « KO y <C 6 «O cro _ó :JX> CÛ 0 s
c
O l/l «O L O O O 0-4 r) * Iro -_£ èc
O « iü i. O o 0 L. ~0 TO _r o L _lJ a r c o <c _ u w O O O k . ~D Tc C O * <73 £ 'I t -0 D _iJ &) _r O V) 3* J r S L t) a_ o*o £ £ i . o D _ u .3 6) "6 «/) £ 0 ~0 ~6 _>J r f G?* 2^ z \ cro £ O «Oo r
J o .Lü L . O O O o w ». X _c O •«? - V cro £ CD <© w 0 O O k. "O Tv» _ r cS
s vJ 1 o D C O e> 0 J o O <D O v£> O * Oc
0 o 3 j-* 0 "0 JTÏ :r O ^ 00 f rQ O — "5 o eO £r*) Ü _C :jrv CÛ CZ) o L tl T> r 0 c V 0 o 6 C 3 0 v V m v> h »i tf°v> \£> \ i'-S 1; <1 X
