\
Lab. Mikrobiologie VERSLAG 82.6
1982-02-05 Pr.nr. 505.0610
Ondert'lerp: Controle tolachttijden
Verzendlijst: direkteur, sektorhoofd (3x), direktie V.K.A., afd.
826
Mikrobiologie (2x), afd. Normalisatie (Humme), Projekt-beheer, Nol (VKA), V. Ingen (dir. VZ), Kan (IPS), afd. Diergeneesmiddelene
Afd. Mikrobiologie 1982-02-05
Verslag 82.6 Pr.nr. 505.0610
Projekt: Ontwikkeling methoden voor het aantonen en bepalen van antibiotica
Ondenolerp: Controle lolacht tijden
Doel:
De aanwezigheid vaststellen van monensin in krop-, maag- en/of dar m-inhoud van mestkuikens. Is monensin aanwezig dan is de verplichte wachttermijn niet in acht genomen.
Samenvatting:
Krop-, maag- en darminhouden van mestkuikens die gevoerd zijn met monensin bevattend voer en zonder monensin bevattend voer en de resp. diervoeders zijn kwalitatief onderzocht op monensin. De twee dier-voeders zijn ook kwantitatief onderzocht op monensin en op de aan-wezigheid van andere antibiotica.
Conclusie:
1. In de kropinhoud is monensin aantoonbaar. In de maag- en darminhoud is met de toegepaste methodes monensin niet aantoonbaar. Deze monsters bevatten vermoedelijk natuurlijke bacteriegroeiremmende stoffen die het aantonen van monensin storen.
2. De onderzochte diervoeders bevatten het antibioticum virginiamy-cine.
Verantwoordelijk: N. Broex Projektleider: drs F.G. Buizer
Medewerker/samensteller: P. Herben, N. Broex
1. Algemeen
In de Verordening Diervoeder 1975 van het Produktschap voor Veevoeder staat dat bij gebruik van het coccidiostaticum manensin een \•lacht tijd van tenminste 3 dagen in acht genomen moet \olOrden voordat de dieren geslacht mogen worden.
Om dit te kunnen kontroleren zijn een aantal krop-, maag- en darm-inhouden onderzocht van mestkuikens die tot het slachten gevoerd zijn met manensin bevattend voer en van mestkuikens die gevoerd zijn met manensin vrij voer.
Indien er bijvoorbeeld in de kropinhoud manensin aantoonbaar is kan men aannemen dat de voorgeschreven wachttermijn niet is nagekomen. Dat het manensin via het voer is toegediend is hiermee niet bet.,rezen \·mnt toediening via het drinkwater is niet uitgesloten.
2. Honsters
Een tweetal series (van 10 en 20 kuikens) monsters krop-, maag- en darruinhoud werd onderzocht. Daartoe tolerden mestkuikens die, bij de mester, gevoerd waren met manensin bevattend voer resp. manensin vrij voer op de afd. Diergeneesmiddelen geslacht en afzonderlijke
mengmonsters gemaakt van de inhouden van krop, maag en darm.
De monsters werden tot het moment van onderzoek bewaard bij + -20°C.
3. Hetboden van onderzoek
3.1 De op de afdeling mikrobiologie algemeen toegepaste screenings-methode voor antibiotica in diervoeders de zogenaamde bacterie-spectrummethode.
3.2 Hoogspanningselektroforesemethode in combinatie met bioauto-graphie. In eerste instantie met het CAl-lAG-elektroforese apparaat en in tweede instantie met een zelf ontworpen elektroforeseapparaat.
4.
Voorbehandeling van de monsters 4.1 le serieVoor de bacteriespectrummethode en de elektroforesemethode werden de monsters van de krop- , maag- en darminhoud zonder verdere voorbehande-ling in de cupjes in de agarlaag gebracht.
-- 2
-4. 2 2e serie
De krop-, maag- en darminhoud t~erden gecentrifugeerd (5 min 3500
er/min) en bovenstaande heldere vloeistoffen t~erden voor verder onder-zoek gebruikt.
4.3 Bijgeleverde mengvoeders t~erden op de gangbare manier
voorbehan-deld en dat wil zeggen 10 g extraheren met 20 ml methanol 50% voor het kwalitatief onderzoek en volgens de geldende methodes voor het kwan-titatief onderzoek.
4.4 De standaard manensin werd opgelost in methanol.
5. Resultaten
5.1 Bij de eerste serie mestkuikens t~as met bacteriespectrummethode
bacteriegroeiremming te zien die mogelijk door manensin veroorzaakt werd (bijlage 1). De krop-, maag- en darminhoud vertoonden alle
bac-teriegroeiremmende t~erking overeenkomend met monensin. De
bloautogram-men na elektroforeren toonden echter dat het niet om manensin ging
maar een andere groeiremmende stof (bijlage 2). Tijdens elektroforeren gaat monensin richting kathode en deze stof(fen) gaat richting anode.
Ook de kuikens die gevoerd t~aren met arprinocide bevattend voer (zie verslag 81.94 afd. Diergeneesmiddelen) vertoonden dezelfde remmingen.
Besloten werd tot het onderzoek van een tweede serie kuikens maar nu
ook kuikens die in het geheel niet \~aren gevoerd met monensin bevat-tend voer.
5.2 De tweede serie krop-, maag- en darminhouden van de met en zonder
monensin bevattend voer gevoerde kippen werden met de
bacterie-spectrummethode onderzocht. De bacteriegroeiremmende t~erking was bij de met manensin gevoerde kuikens iets groter dan deze met zogenaamde
blanco voer gevoerde dieren. Alle monsters vertoonden groeiremmende werking (vermoedelijk van een antibioticum in het oorspronkelijke
diervoeder) (bijlage 3). De bloautogrammen gaven het zelfde beeld als
bij het eerste onderzoek: een sterke groeiremmende werking in de richting van de anode. Deze vermoedelijk natuurlijke remming is het duidelijkst in de maag- en darminhoud.
-- 3
-Omdat de remmingszone van het standaard manensin niet duidelijk en
scherp 1o1as bij de CM-lAG-apparatuur met de TRIS-maleïnezuurbuffer 1o1erd
besloten om het oude elektroforeseapparaat met de fosfaatbuffer te
gebruiken.
Nadat de kropinhouden van de zogenaamde blanco kippen en de zogenaamde
positieve kippen waren geextraheerd met 90% methanol bleek manensin
aantoonbaar in de kropinhoud van de met manensin bevattend voer gevoerde kippen (bijlage 4).
De geleverde diervoeders 1o1erden met 50% methanol geextraheerd en
manensin 1o1as aantoonbaar in het voer met de toevoeging (bijlage 5).
5.3 Omdat er uit de patronen van de screeningsmethode bleek dat er
naast manensin mogelijk ook een ander antibioticum in het voer zat
1o1erden de diervoeders verder onderzocht op de aamo1ezigheid van
anti-biotica. De voeders bleken elk 10 mg/kg virginiamycine te bevatten.
5.4 K1o1antitatief onderzoek van de kropinhoud was niet mogelijk omdat
de hoeveelheid te klein was.
6. Conclusies
6.1 Manensin is aantoonbaar in de kropinhoud van vers geslachte
mestkuikens, als deze tot het slachten gevoerd zijn met voer dat
ongeveer 80 mg/kg manensin bevat.
6.2 In de maag- en darminhoud storen vermoedelijk natuurlijke remstof
-fen de kwalitatieve bepaling van monensin.
6.3 Alléén de zogenaamde bacteriespectrummethode is niet voldoende om
manensin aan te tonen, een bevestiging met hoogspanningselektroforese in
combinatie met bioautographie is nodig.
6.4 Arprionocide en virginiamycine storen niet bij de k1o1alitatieve
bepaling van manensin met de hoogspanningselektroforesemethodiek.
7. Discussie
Uit de resultaten blijkt dat het mogelijk is manensin in de kropinhoud
van mestkuikens aan te tonen.
-- 4
-Het zal echter moeilijk zijn aan te tonen dat de wachttijd van 3 dagen niet in acht genomen is, want als er iin dag manensin vrij voer is gegeven is er waarschijnlijk al geen manensin meer aan te tonen met de nu beschikbare methode. Verder onderzoek is dus nodig.
Een kl-1anti tatief onderzoek in de kropinhoud van iin kuiken is moeilijk omdat de hoeveelheid beperkt is en soms sterk varieert. Mogelijk dat wel met verzamelmonsters te werken is van bijvoorbeeld ifin kop-pel kuiken.
Bijlage 1
Bacteriespectrum kwalitatief onderzoek 1e serie
B.cereus pH 6 KROP
+++
MAAG+++
DARM++
STANDAARD MONENSIN++++
+
++ +++++++
826.5 remming van 10-12 mm 13-16 mm 17-20 mm 21-24 mm B.cereus T.R. pH 8 pH 6+
++
+++
+
++
+
+++
T.R. pase pH 6 ++++
+++++
M.albus S.lutea B.subti- M.flavus s.aureus E.coli
DHSR lus pH 8 pH 8 pH 8 pH 8 pH 6 pH 6
++
-
+
++
-
+
-
+
+
++ -+
+
-
-
+
++
+
Bijlage 2 Bloautogram CAHAG-app. anode 1 maag 3 krop 4 = manensin 5 = darm 826.6
Kwalitatief onderzoek le serie
•
"--...._,
( '\
I
~ijlage 3
3acteriespectrum kwalitatief onderzoek 2e serie
B.cereus B.cereus T.R. T.R. M.albus S.lutea B.subti- M. flavus s.aureus E.coli B.cali- B. calido
-pa se DHSR lus dolact is lactis + pase
pH 6 pH 8 pH 6 pH 6 pH 8 pH 8 pH 8 pH 8 pH 6 pH 6
zg. blanco kuikens
KROP ++++ + +++ +++
++
+ + ++++-
++
+++
+++MAAG +++ + +++ +++
-
-
-
+++-
++
++
++
DARM +++
++
+++ +++-
-
-
-
-
-
+t-++
met manensin bevattend voer gevoerde kuikens
KROP ++++
++
+++ +++++
+++
++++ +++
+++ +++MAAG +++ + +++ +++ + + + +++ +
++
++
++
DARM +++
++
+++ +++++
-
++
+ +-
+++ +++bij geleverde meng
-voeders 31866 + + + +
++
++++
-
++++
++
-
++++++++
31867++
++
++
++
++++++++
++
+++++
+++-
+++++
+++++
St.manensin+++++
+++ +++ +++-
-
-
++
-
-
+++++
+++++
+=
zie bijlage 1. 826.7Bijlage 4
Bioautogram RIKILT-app.
Kwalitatief onderzoek 2e serie
l kropinhoud blanco kuikens na extractie met 50% methanol
2 kropinhoud blanco kuikens na extractie met 90% methanol
3 standaard monensin
4 kropinhoud zg. positieve kuikens na extractie met 90% methanol
5 = kropinhoud zg. positieve kuikens na extractie met 50% methanol
Bijlage 5
Bioautogram Kwalitatief onderzoek
Geleverde diervoeders RIKILT-app.
.··-...
' I'(
.
,
' ....__
,
.
.
,
• 'f 1=
31866 2 standaard manensin3 standaard virginiamycine
4 31867
5 = controle monster
826.9
