Sulfanamiden in dierlijke produkten. Lab. 21 Contaminanten
Verslag 00.11 pr.nr. 7.304 1980-05-19
7912003 RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR LAND- EN TUINBOUWPRODUKTEN WAGENINGEN Lab. 21 Contaminanten Vers lag 80.11 pr.nr. 7.384 1980-05-19 Projekt: Ontwikkeling van methoden voor het aantonen en bepalen van
diergeneesmiddelen.
Onderwerp: Sulfonamiden in dierlijke produkten. ~
Voorgaande verslag: pr.nr. 7.384 d.d. 1979-06-20.
Doel:
Het 0ntwikkelen van een multi-detektiemethode voor sulfonamiden in dier-lijke produkten m.b.v. H.P.L.C.
l<onklusie:
De beschreven methode in bijlage 1 zou goed bruikbaar zijn, de recoveries voor blanco + toevoeging en monster + toevoeging zijn 74% en 60%, wanneer de interferentie met dezelfde retentie als sulfadimidine in het chromate-gram ondervangen kan worden. Een breder onderzoek naar de mogelijkheden voor de toepassingen van fluorescamine en de opwerkingsmetbode van Carl. W. Sigel et al.zou perspektieven kunnen opleveren. Het toepassen van ion-pair vloeistofchromatografie, met een alkylsulfonzuur als counter-ion in een gebufferd milieu, zou de retentietijden van interferenties en sulfonamiden veranderen.
Vet'antwoordelijk: ir L.G.I·I.Th. Tuinstra. ;/
Hedewerkers G. van Bruchem, \V.A. Traag '-1'
7912003
RIJ KS-KWALITEITSI NSTITUUT VOOR
LAND· EN TUINBOUWPRODUKTEN
WAGENINGEN
1. Inleiding:
~ulfonamiden worden toegevoegd aan veevoeders voor de bestrijding van bakteriële infekties. De meest toegepaste sulfonamide is sulfadimidine
(tabel 1). Via het slachtdier kunnen residuen van sulfonamiden terecht komen in produkten bestemd voor menselijke konsumptie. In Nederland zijn residue toleranties voor sulfonamiden in vlees en vleesprodukten niet bekend, hoewel er in Amerika een residue tolerantie gehanteerd wordt van 0,1 mg/kg. Vanuit volksgezondheidsoverwegingen is het noodzakelijk er voor te zorgen dab produkten van dierlijke oorsprong geen (ontoelaat-bare) gehalten aan sulfonamiden bev.atten. Gezien de grote verscheiden-heid aan sulfonamiden, welke in principe therapeutische toepassings-mogelijkheden hebben en aan de andere kant de onbekendheid met de
samen-stelling, uit het oogpunt van de verschillende sulfonamiden en hun
kon-centraties~ van het veevoeder is het absoluut noodzakelijk een multi-detektiemethode voor sulfonamiden beschikbaar te hebben op een niveau van 0,01 - 0,05 mg/kg op produkt basis.
2. Werkmethode 2.1. Apparatuur en hulpmiddelen: Zie bijlage 1. 2.2. Reagentia en Chemicalien: Zie bijlage 1. 3. Experimenten en Resultaten:
Er is begonnen . ·met een literatuuronderzoek op het gebied van de bepaling
van sulfonamiden in dierlijke produkten.
Tot de konklusie is men in dit onderzoek (verslag 1979-06-20) gekomen dat men in eerste instantie de methode van het R.I.V. (rapport no, 169/78 LCLO) zal nawerken. Als eerste is er onderzocht bij welke verhouding van water-methanol de k' -waarden van de sul fanamiden zoveel mogelijk verschilden, Oij een verhouding van water-methanol 85:15 zijn drie verschillende meng-sels van sulfonamiden samengesteld , ~~n mengsel van 5 sulfonamiden, ~~n van 4 sulfonamiden en ~~n van 3 sulfonamiden (tabel 2). Het nawerken van de R.I.V. methode (1) is verder enkel uitgevoerd voor de meest toegepaste sulfonamide namelijk sulfadimidine. De recovery voor een blanco +
toevoe-ging (10.000 .ng) was 18% dit in tegenstelling met het R.I.V. resultaat (60- 90% recovery) . Dit verschil zou te wijten kunnen zijn aan het feit dat wij een andere eluenssamenstelling en residue-oplosmiddel gebruiken in vergelijking met de R.I.V.-methode, maar uit een gedetailleerd onder-zoek bleken er grote verliezen op te treden in de verschillende
opwerkings-stappen (tabel 3).
RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR
LAND· EN TUINBOUWPRODUKTEN
WAGENINGEN
-2-7912003
Het grootste verlies werd veroorzaakt door een niet optimale pH tijdens het uitschudden met dichloormethaan. Door het uitschudden met dichloor-methaan nog 2 keer te herhalen en door de optimale pH eerst te bepalen, en daarna te gebruiken, is in deze ene stap de maximale recovery bij pH
5,5 80% en werd de recovery voor blanco + toevoeging in de totale werk-wijze verhoogd tot 30%.
Na overleg met dhr. Vaessen van het R.I.V. is besloten de toegevoegde hoeveelheid sulfadimidine (10.000 ng) te halveren.
Hierdoor werden de reeoverles voor blanco +toevoeging en voor monster+ toevoeging respectievelijk 74% en 60% (chrom. 1,2 en 3).
Het indampresidue was opgelost in methanol en dit gaf een slechte
recovery (chrom 2); door zoutzuur toe te voegen werd de recovery
verbeterd (60% en 74%), De poging om de recovery nog meer te verhogen
door azijnzuur i.p.v. zoutzuur aan het residue toe te voegen leverde geen verandering op.
Na verlaging van de toevoeging bleek de optimale pH voor het uitschudden
6,5 te zijn (tabel 4). Dit verschil is niet goed te verklaren. De uiteindelijke door ons voorgestelde methode voor de bepaling van sulfadimidine in vleesprodukten is beschreven in bijlage l.
Alle verdere uitgevoerde bepalingen ter verbetering van de recovery van sulfadimidine in vleesprodukten leverden een interferentiepiek op die dezelfde retentie had als sulfadimidine, ook was het niet meer moge-lijk met de methode, beschreven in bijlage 1, te werken zonder deze inter-ferentie. Een oplossing om deze interferentiepiek te ondervangen werd niet
gevonden. Hierna is een onderzoek gestart naar de bepaling van sulfadimidine in vleesprodukten m.b.v. dunnelaagchromatografie en fluorescentiedetektie (1). Als fluorescentiederivaat is fluoresaamine gekozen omdat fluoresaamine
zelf niet fluoresceert maar wel in kombinatie met primaire aminen zoals
sulfadimidine.
Op de silicagelplaat werd gebracht: a) sulfadimidine,
b) fluorescamine, c) triäthanolamine,
d) een mengsel van fluoresaamine en triäthanolamine, .
e) een mengsel van sulfadimidine, fluoresaamine en triäthanolamine.
(l) Carl W. Sigel, Joseph L. Woolley jr., Charles A. Nichol, J. of Pbarm. Se.jvól64, no. 6,june 1975, 973-976.
-3-7912003
RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR
LAND- EN TUINBOUWPRODUKTEN
WAGENINGEN
-3
-Alleen het mengsel van sulfadimidine, fluoresaamine en tri~thanolamine was goed waarneembaar met U.V.-licht. Wanneer het mengsel van deze 3 verbin-dingen op de plaat wordt gebracht dan is di~thylether door C.W. Sigel
gebruikt als loopmiddel niet polair genoeg en moet er azijnzuur toegevoegd
worden.
Bij een mengsel van di~thylether-ijsazijn (9:1) is de Rf-waarde 0,6 voor
het complex van sulfadimidine en fluoresaamine en de detektiegrens 2 ng. Het U.V. -spektrum van het complex met tri~thanolamine opgelost in metha-nol geeft geen maximum.
Mogelijke oorzaak hiervan zou de pH kunnen zijn. Een nader onderzoek in
deze zou aanbevelingswaardig zijn.
l<onklusie:
De beschreven methode in bijlage 1 zou goed bruikbaar zijn, de recoveries voor blanco + toevoeging en monster + toevoeging zijn 74% en 60%, wanneer
de interferentie met dezelfde retentie als sulfadimidine in het chromato
-gram ondervangen kan worden. Een breder onderzoek naar de mogelijkheden voor de toepassingen van fluoresaamine en de opwerkingsmethode van Carl. W.
Sigel et al. zou perspektleven kunnen opleveren. Het toepassen van ion-pair
vloeistofchronatografie, met een alkylsul fanzuur als counter-ion in een gebufferd milieu, zou de rententietijden van interferenties en sul fo.namiden veranderen.
7912003
RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR
LAND- EN TUINBOUWPRODUKTEN
WAGENINGEN
Tabel l.
Struktuur en fysische eigenschappen.
Sulfonamiden Struktuurformule sulfanilamide H2N- -S02NH2 sulfapyridine Hil- -S02NH sulfadiazine H2N- -S0 2NH sulfadimethoxine H N -2 -S02NH sulfachinoxaline H2N- -S02NH sulfamerazine H2N- -S0 2NH sulfathiazol H 2N- -S0
2
t~H sulfadimidine H2
t~--S02NH sulfadimidine-Na H 2N- -S02-sulfamethoxydiazine H 2N- · -S02 NH-sulfacetamide H 2N- -S02NH-eO-eH3 sulfaguanidine H2N --S02NH-epi< a Oplosbaar in Smeltpunt
10,4 H2o,e 2H50H 165 oe 8,4 H2o,e 2H50H 191 oe 6,4 H2o,e2H 50H 255 oe 6,0 6,5 H2o,e2H50H 247 oe 6,9 H2o,e2H 50H 234 oe 7,2 H2o,e2H50H 202; 175 oe 7,6 H2o 198 °e 5,4 H2o,e2H 50H 182 oe H2o,e2H50H 190 oe
RIJI<S·I<WALITEITSINSTITUUT VOOR LAND- EN TUINBOUWPRODUI<TEN
WAGENINGEN
Tabel 2
Retentietijden van sulfonamiden in water-methanol 85:15 mengsel.
Sulfonamide Retentietijd in sec.
sul f anilandde 115 sulfapyridine 217 sulfadimethoxine 1350 sulfadimidine-Nä 292 sulfadiazine 168 sulfachinoline 1266 sulfamerazine 231 sulfadimidine 312 sulfacetamide 117 sulfathiazol 1752 sulfamethoxydiazine 261 sulfaguanidine 112
RIJKS·KWALITEITSINSTITUUT VOOR LAND· EN TUINBOUWPRODUKTEN
WAGENINGEN
Tabel 3
Overzicht van de verliezen in :de diverse opwerkingsstappen. 10.000 ng sulfadimidine in methanol
extraktie met
aceton/chloroform
+ HCl +afdampen
extraktievloeistof
overgedampt mengsel bevat~ 2500 ng sulfa-dimidine
~ 7500 ng HCl residue
extra-heren met ether + HCI fase filtreren
en overbrengen in H 20
----'~ etherfase bevat ~ 520 ng sul fadimidine overige verliezen~3180 ng sulfadimidine
-v 3800 ng '\, l/5 gedeelte + citraat-oplossing op pH brengen + extraheren met CH 2C.l2 +
t
gedeelte van de CH 2c12 fase indampen + residue oplossen in methanol180 ng sulfadimidine zou bij 100% recovery overeenge
-komen zijn met 1000 ng sulfadimidine.
pH 2,0 4,5 5,0 J 6,0 6,5 8,4 7912003 RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR LAND· EN TUINBOUWPRODUKTEN WAGENINGEN Tabel 4
Overzicht van de recoveries van sulfadimidine in de laatste
opwerkings-stap door variaties van de P.H.
de toevoeging was 5000 ng opbrengst na lx uitschudden
met CH
2c12 opbrengst na 2x opbrenst na 3x totaal
834 ng 767 ng 282 ng 1883 ng 3304 ng 983 ng 207 ng 4494 ng 3171 ng 850 ng 170 ng 4191 ng 3281 ng 927 ng 109 ng 4317 ng 3684 ng 915 ng 103 ng 4702 ng 4102 ng 884 ng 103 ng 5089 ng 1008 ng 1225 ng 699 ng 2932 ng recovery 38% 90% 84% 86% 94% 102% 59% i)
7912003
RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR
LAND· EN TUINBOUWPRODUKTEN WAGENINGEN
Bijlage 1
De bepaling van sulfadimidine inluncheo~meat m.b.v. H.P.L.C.
1. PL'incipe:
Het monster wordt in een mengsel van chloroform en aceton (1.1)
gesuspen-deerd en vervolgens gefiltreerd. Door selektieve extraktie met
verschillen-de oplosmidverschillen-delen wordt sulfadimidine van het vet en andere mee-ge~xtra
heerde bestanddelen gescheiden en ver.v_olgens met vloeistofchromatografie bepaald.
2. Apparatuur en hulpmiddelen
2.1. vloeistofchromatograaf, ACS
2.2. injektiekraan, Valco en voorzien van een loop van 20 ~1
2.3. U.V.-detektor, Pye Unicom, golflengte 270 nm
2.4. recorder
2.5. R.V.S.-kolom, lengte 15 cm, inwendige diameter 4,6 mm
2.6. frits 2 ~m 2.7. Waring-Blender
2.8. ratorvapor
2.9. pH-meter
3. Reagentia en chemicali~n
3 .1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7.
Alle reagentia en chemicali~n dienen van een analytisch zo zuiver
mogelijke kwaliteit te zijn.
aceton chloroform Dichloormethaan di~thylether methanol water zoutzuur, 5 mol/1 3.8. natriumhydroxide, 4 mol/1
3.9. natriumcitraatoplossing, verzadigd
3.10. nattiumsulfaat, watervrij
3.ll. sulfonamiden:stam J)plossingen 100 ~g/ml: standaardoplossingen: 500 ng/rnl 3.12. elutievloeistof: water/methanol 85:15
3.13. pakkingsmateriaal: Lichrosorb 10 RP-18
-2-7912003 RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR LAND- EN TUINBOUWPRODUKTEN WAGENINGEN 4. Extraktie:
-2-- meng 50 g vlees met 100 ml aceton/chloroform (1.1) in een Waring-Blender.
- voeg hieraan eventueel SOOO ng sulfadimidinestandaard in methanol.
- suspendeer 30 sec. bij lage snelheid en 1 min. bij hoge snelheid.
- filtreer de organische fase over een vouwfilter in een rondbodemkolf van 1000 ml.
- breng de suspensie opnieuw in de W-B beker terug en voeg opnieuw 100 ml aceton/chloroform toe
- suspendeer weer zoals l1ierboven vermeld en herhaal dit nog ~~n keer
- voeg aan de organische fase in de rondbodemkolf S ml zoutzuur (SN) toe
- damp de organische fase af bij 20
°e
m.b.v. een rotarvapor- breng het residue kwantitatief over in een scheitrechter van 2SO ml met 4 x 2S ml di~thylether
- schud 30 sec. en laat de fasen scheiden gedurende l uur
- filtreer de zoutzure fase door een vouwfilter en vang het filtraat op
in een maatkolf van 50 ml.
- spoel het filter 2x na met S ml water
voeg aan de di~thyletherfase opnieuw 5 ml zoutzuur (SN) toe en herhaal bovenvermelde 3 stappen nog 2 keer
- vul de maatkolf aan met water tot de streep
- pipetteer 10 ml van deze oplossing in een bekerglas van 100 ml.
- voeg 50 ml van een verzadigde natriumcitraatoplossing toe
- breng de pH op 6,S met natriumhydroxyde (4N) of met zoutzuur (SN)
- breng deze oplossing kwantitatief over in een scheitrechter van 2SO ml.
- spoel het bekerglas na met 2 x S ml water
- voeg 20 ml dichloormethaan toe
- schud 2 min. en laat de fasen scheiden.
- filtreer de dichloormethaanfase over een trechter gevuld met
natrium-sulfaat in een platbodemkolf van 100 ml en spoel de natriumsulfaat 2x
na met S ml dichloormethaan
- herhaal de stappen van af: voeg 20 ml dichloormethaan toe, nog 2 keer
- damp de dichloormethaan af bij 20
°e
m.b.v. een rotarvapor - los het residue op in 1 ml methanol+ 2% zoutzuur (SN).
7912003 RIJKS-KWALITEITSINSTITUUT VOOR LAND- EN TUINBOUWPRODUKTEN WAGENINGEN Chromatografie:
-3-H.P.L.C. kondities:flow: 1,0 ml/min
kolom: 15 cm R.V.S. inw. diameter 4,6 mm
pakkingsmateriaal: Lichrosorb 10 RP-18
eluens: water-methanol 85:15
loop: 20 lll
gevoeligheid detektor: 0.005 aufs golflengte detektor: 270 nm
gevoeligheid rekorder: 10 mV
papiersnelheid rekorder: 1 cm/min
- injekteer 20 lll van de standaardoplossing (500 ng/ml) en bereken het piekoppervlak
- injekteer 20 lll van het monster opgelost in 1 ml methanol + 2%
zoutzuur (SN).
Berekening:
Berekenhet sulfadimidine gehalte van het monster in mg/kg m.b.v. de
formule:
Om
gehalte sulfadimidine in mg/kg
=
x CsOs 100
waarin:
Om
= het oppervlak van de
sulfadimidine piek van het monster Os=
het oppervlak van de sulfadimidine piek van de geinjekteerdestandaardoplossing
Cs
= de
concentratie in llg sulfadimidine per ml van de geinjekteerde standaardoplossing.Wageningen, 1980-05-19.
Verzendlijst: Van Doesburgh,
Buizer, Tuinstra, Traag,
w.
Van Bruchem,
Afdeling Contaminanten, Circulatie.
I
I I'!
!
~II~
I
.
:
t->
I,
.
I I . I 1 -. II
I I . ··-I ' :: !
11 . I ;I
iI
I
II'
II
;
) ; : . ' -::; '· ----~~----4-.~--.+---~-~~..
~--.~----+--·~·--~:~i-- ~--~~~--~--:'"
/~
:
_:r-
;_
,_
~
-
·
~----L-
;
~
~~1!
I
.
I
----i---1 I - - : - - - 1 - - - - -'---4 . i I:
!
~
l
I : I I I \ I I . . i II
I •j
. .. I,
: :.
I
:
I
!
. i:
l
I . f}- -' -I I .!
I
i
! ~rI
'
a
_
1-I
. I:
3
I..
\
:
~!
·1
:
'
'
- , - - - - -1-- - .. --P."'~-1---+-'---=-·1---- - ' . • 1t'-. fJ ___ · :Î!
:
.
,
'
p
·
I - . 1... ' ·, I I I : I . I I. : 'I
' ' . . . ( : I .i
I I ; ; ; I ! -· i I !~
! ----"1'--K.-l!--.'- . - - T - --4-- -·1---1--' 'l
-~--,
-,-]l-J+--L----1---i!:._,l,...:!~i:_
,
___;__:-+---'--'--'--+-,---'--
1
I
--
r--
--
--
~
~:-
.
t--
,-
·
.
+-
t
-l=:_
:_=-:r-tl-
:
=-.l=:!::.
!
:i
:
=.:;:;::;:;~
_
~~ =~ ~
:
.-~~J~~
-
~
-~
_J
.·
l~
_
l\
lllll
i
~~
L
~7"~ -1---l-:--~-f-!
,--- :-t
·
-~---1
~-~~~~i ~~~~~
:
~i
i'
~
:
~~·
:
~~~~
~~~~
= I I · ' ; : ' ! ·. ' • i I ; , I I . I I I I 'I
T
I I i ' ! ' ; I--
,--_
:
~
'
:
6
s~ri
:
:'
-
---t--
·--
1--~---t
-:'--
11- l -~
-~-'--~ -
~"""'"'-=.4~
-·
!.>--
·
=i'nO'--hl>
-.i
-'-..l~
\-\
~-<--
'
--,--+....;..---1-- - + - - - 1 - - ; _' - 1----t----,--'----+----t---; I •j j
'
1 .J. $)--. . "_', ~"ti;
"'
1
!I
j ' 0 I~- J. J; ~! '~i I ' L ~~; f.i-. 1I
:
! •.,
~I I I ' I ' I ' I.
' . ! j I I I I I I , I ·l : I(
I !..
' I II
:
j
l
I I I ~ I i·.L . I I ---···-
-I
i
--
tl
__
_I
•
~-
----
~
~
-
J
'
-
~
-: J___
~~;H-7
----;--
,
.--t--:1/.,J-;~-
---~
--
---
·
I
Ii'
·
I ' . - -· -1 . - ·- - - -t--- .. -j- - · --- ---i - ~ .. , .... ---;-~-l-~~-~--~- : . I_/p
. ' I : : j ; __L_:_.
:~
...-'--
+-:
:--
-
-1
-
-
- - - l - -- -- t- - --f-
~-
+-+-- - -,-~
.
.
---~.-
--
---;-
1+-+--ï-
'
·
! I : ' ' ' . i. ('. ' ' : ' l I : ï ii
I I . :J---
~
-
c:~~
-
II
! Ii
;
l . ; i :,. :,·· ' I : i . ... IA
'
i I I I :1 I I ' i , . I i, ~,,_~.
: : I I "' . : ·,·: . I I I j ! I I I ; ! I ' :i
~ --.l :_:<> ·:; ' ..u I • I 1 0 I,- I I • I I __l..d . -: . ___r:. . ': I __i__._:___!. :!
i ' I·
~
·
I. :, ' ' I '. · ,. ;~
·:
:';/! I C)l \..!..) I I I:
'>
i
i !·- -.-,---(j- --:---:-1 i 1'1 I : I II
I·!
! ' ;C; ·~..,. I ~ ~V
i Ii
I ,_, :; . , , , , i, : ' I I 1 1 •. : ''~· ~..-'--: ' I I Î ' ' ':::
.~
~
~
~-
~
~~
~:
~
:_
;
~
,~-;~-r
~~
-t
----' . ' ' : : : ' ! ', : . ' I . . I : I : ! 1(: . I ' ...;,.--_ _L ! 1· • • I : . : : . • ' ! _;_ --~-- - ....--.-- ' ', • ' • fT~-7-1 r- I I~ : 11\ : , , .!
i : -- , ---'- --;---:-!- "'1"'T1' -;- !' !-, . . : . . I ' ! ' II .
i--:-t\; C:J : C]:a
I~:
!
I I~
~
: ! • I ; : ; . . : , : l ' j : ' I-
~r-'
!
:
~
l
~
:
cJ
,
I ' I I . I : ! . . . . I . . I r---IJ ·-,." I ;a_. ' .'
F
--
'
---li-
-
·
:-t-jij;;._r
u_
l-:-~j
1:~
i
~~
J
-1;-:-
'
_:;
_~
~
-
~
--:
_
-
-_-
+
~
-+:
·
-
~
~
;
~
-:
+
----
~-
-+
1
+
:
+
-t
-
~
--
~
-,
:
_
_
:_
(c~p
,
~: ~
~~
-
-
=-
~~~~~'l.=
·
=l:
+=:F.
~:~
~t
;t-
!
:
11
:
:
-:-;
1
_
!
~:~
:
:
:
;
__
_j
Ii
i
' ;
! I ' ' II
-
;
"
'
'
'
. , . ______ - -. ---+---'-111
\r-:-r~-'-,-l--r-:----'---r-·---~ 1 1_~
-
~~
f
-
i ~
-
1
1 i
-;-~
~
;
;
'
-
---
--
--
-
--
-
'''
ll_
'
"
'
. . I : i ! : : Ii
.
.
.
'
.
.
. .
:
I - - - · - - - -..::::===1~==
~
~----L:o...:
:.:..:::
:..:
1--· . :.!
_
._
1
~....!....;.~
-
---' _. _l., --. ----1--- ' --- - - i ·1-...:...- - ·t- -• • • j • I I • I • • • Ii
-
+
~
--:
~
' -
·
:
~
'
:
_
_
:
i
;
:
~
-
-
-
~
:_
'
(
:
~~
:
;l
l
!
.!
-
l
l,
:
.
~
-
t
:
!
!
..
1i!
i
llii
·
li!
l!i!
;
it;j
l
_
i
·
i
fTP
_:,_j!--:-;
-t
-,-
-
---. -:..,... _ _:i_L~...:.--;·-:-r· ~-.-. ! i'r
·-
r
--.-
.
.
~..!. -
~
--
·-:---:-:
: : i . , ; I : ,,.·~
·
I ' ' , !~ ~·
;!
I
'
-
.
;
,
;
~
' ' , • I 0 : ~.· ·,! ~ .;• : : : :,. i l I•• :---:---r--~~~~
0
'I I :~: ::I 0.. ' . ! I
;_
~
---
~
-:
-
-
c---1
·
l
_:
_
_
i~ ~+~
~
1
1
-
·
:---r-
,
~~~
:
J
J~~-
~
-
_!_~
__:..:
--W!
..l'~·_!_!
-t~
.
-+i
__l
.
-H,-11~-HI
~i
~
~~
:
+
~
~
~:
~
.
>l,..,r-
_
.t
1
!
~
ci
,
~
o
:--r
t--o
1
'\_
-"-::
;
~
2~o0
!
-
~-~---
L
'
'
:
J
i
::
.
~
·
~
~~
~
~~
~
~
~
:
r
~
~
~i~'
~r
T~~:
.
~~--:-
~t~~v
~
·
-
~
-
~-
~
2t~~
--
-. i J'
I~
~
~
,
. 1~
:
.
•:
.CS_ . I~
lt
'
;
.
>Z
·
-l-
-!---
,;_
!
-'-:
-t
_
I
_.
_,_
~
,:.
Jtj
,.·
·
·
.
J
-
·
--
-- .__ __ ._:_, :_:.~. •_..._,· . ---.- ....!...-:-... -:- 1-- - r - , -- _ . .j...::- -7--+ 7-:--:-;-f-·-;- ;-1 . r--- I t I ' I : ' • • ' • • I I • • . : • I I ! I I : I ' • . · j I , · j I 1 ' --+-'---:-- t_:_'2_1 ..:_. ! . . . . l '...!.
1
...:...;.._
~
1
-:--,
7-1r--+-'--· _:_, ______ - - --t~
-'--
---J---,.--
jl'
-·--
-
-+---
·
1
-~
~
-:
-
-
~
-
--
-
-·
I
II
I . . . .1
1
~.
L
_
__
-·
~
L
~~
=·
=
:.~:
:1-L++ij:._:_
~
.
_L:
-=-
-~
"~
=
=
=
==
~·
-
--
-
-
-
~-
--=
-
-
.
-,
_
-
r
-
-
:
~
i :;1
;
·
_
-
j
__
,,\ · ' I : ' I I ' I r -·· .. I ~ I
