Uitscheiding van dienestrol en hexestrol in urine van met deze middelen behandelde vleesstieren

(1)

Afdeling SERH

RAPPORT 84. 96

1984-11-07 Pr.nr. 505.0621

Onderwerp: Uitscheiding van dienestrol en

hexestrol in urine van met deze middelen behandelde vleesstieren. Voorgaand verslag: 84.6 interim rapport.

Verzendlijst: direkteur, direktie VKA, sektorhoofd, afdeling SERH (10x),

afdeling Normalisatie (Humme), projektbeheer,

(2)

(3)

Afdeling SERH 1984-11-07

RAPPORT 84. 96 Pr.nr. 505.0621

Projekt: Ontwikkeling residubepalingen voor dienestrol en hexestrol met behulp van behandeling van een aantal vleesstieren. Onderwerp: Uitscheiding van dienestrol en hexestrol in urine van met

deze middelen behandelde vleesstieren.

Voorgaand verslag: 84.6 Interim rapport.

Doel:

Onderzoek op de aanwezigheid van dienestrol en hexestrol in urinemon

-sters van proefstieren.

Samenvatting:

In dit rapport zijn de resultaten van de bepaling van dienestrol en

hexestrol in urine van met deze stoffen behandelde vleesstieren

ver-meld.

Verder zijn de uitscheidingacurven van dienestrol en hexestrol weerge -geven.

Conclusie:

Eén dag na injektie bereikt dienestrol zijn maximum. Na 1-2 dagen na injektie bereikt hexestrol zijn maximum. Het gehalte dienestrol neemt na+ 4 weken af tot onder de 5 ng DE/ml. Voor hexestrol geldt dat het gehalte hexestrol na+ 2 1/2 week afneemt tot onder de 1 ng HEX/ml.

Verantwoordelijk: dr W.G. de Ruig

Hede,.,erkers/samenstellers: Th.H.G.~an, G.D. yan Bruchem Projektleider: dr W.G. de

Ruig

-

~-

~·

~

(4)

1. Inleiding

Er is een proef uitgevoerd waarbij vleesstieren zijn behandeld met dienestrol, respektievelijk hexestrol.

De proef diende voor verschillende doelen:

1. Inzicht te verkrijgen in de uitscheiding van dienestrol en h exe-strol bij met deze stoffen behandelde runderen.

2. Het in handen krijgen van materiaal van met dienestrol of hexestrol behandelde dieren.

3. Het ontwikkelen, testen en valideren van analysemethoden voor het aantonen en bepalen van dienestrol en hexestrol in dit materiaal.

In deze proef werkten samen: !VVO, RIVM en RIKILT. De proef is als volgt verlopen.

Er zijn 6 vleesstieren op het !VVO als volgt behandeld. Op 1983-12-12: - 2 blanko, nrs. 75 en 91

- 2 met 100 mg dienestrolacetaat, nrs. 78 en 85 - 2 met 100 mg hexestrolacetaat, nrs. 79 en 89.

Er is urine van deze dieren verzameld op dag -6, 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10,

15, 18, 22, 25, 29, 36, 43, 50, 57, 64 en 71.

Op 1984-02-27 zijn de dieren nrs. 79 en 85 opnieuw behandeld met hexe-strol respektievelijk dienestrol. Deze dieren zijn geslacht op

1984-02-29 en er zijn de volgende materialen verzameld: bloed, injek-tieplaats, rugstrekker, diafragma, lever, nier en niervet.

Van het aldus verkregen matertaal zijn bloed en injektieplaats door het RIVN meegenomen en bewaard. Het overige materiaal is op het RIKILT gesneden en verdeeld in 2 porties, voor RIVM en RIKILT.

Van de RIKILT portie is een deel gevriesdroogd en een deel ingevroren. De monsters worden bewaard bij -20°C.

2. Onderzoek urinemonsters

De urinemonsters zijn door het RIKILT onderzocht volgens verschillende methoden.

Radio-immunochemische bepaling van DES in runderurines na chromatogra-fische voorzuivering met behulp van een chromatolithe A kolom, RIKILT intern analysevoorschrift A 270. Resultaten uitgedrukt als "DES". Deze resultaten zijn vermeld in interim rapport 84.6.

(5)

-- 2

-Radio-immunochemische bepaling van HEX/DE in runderurines na chromato-grafische voorzuivering met behulp van een chromatolithe A kolom, RIKILT intern analysevoorschrift A 380 respektievelijk A 381.

De resultaten van dit onderzoek zijn vermeld in dit rapport.

3. Resultaten

De resultaten van het onderzoek zijn verzameld in de tabellen 1 en 2. Tabel 1 geeft de gehalten aan HEX in de urine van de met HEX behandel-de dieren nrs. 79 en 89, alsmede van enkele monsters van de niet be-handelde dieren nrs. 75 en 91.

De uitscheidingscurves van HEX zijn weergegeven in figuur 1.

Tabel 2 geeft de gehalten van DE in de urine van de met DE behandelde dieren nrs. 78 en 85, alsmede van enkele monsters van de niet- behan-delde dieren nrs. 75 en 91.

(6)

- 3

-Tabel 1. Bepaling van hexestrol in monsters urine.

Hethode: Intern analysevoorschrift A 380, met gebruik van

antiserum RIVM-0646/0647 en radiolabel 3H-HEX

Datum Dier- Dag na RIKILT

monstername nummer behand. nummer Res 1 Res 2 Res 3 Geruid.

~g/1 ~g/1 ~g/1 ~g/1 1983-12-06 75 -6 835001 0,30 0,20 0,15 0,22 1983-12-16 75 4 835061 0,49 0,71 0,37 0,52 1984-02-21 75 71 8462197 0,18

o,

72 0,05 0,32 1983-12-06 79 -6 835005 0,32 0,26 0,60 0,39 1983-12-12 79 0 835017 0,12 0,18 0,38 0,23 1983-12-13 79 1 835029 486 628 761 625 1983-12-14 79 2 835041 294 330 346 323 1983-12-15 79 3 835053 215 213 251 226 1983-12-16 79 4 835065 111 209 151 157 1983-12-19 79 7 835077 54 74 65 64 1983-12-22 79 10 835089 63 117 85 88 1983-12-27 79 15 835101 28 44 40 37 1983-12-30 79 18 835113 3,36 3,82 3,80 3,66 1984-01-03 79 22 846215 0,33 1,28 0,39 0,67 1984-01-06 79 25 8462117 0,42

o,

77 0,47 0,55 1984-01-10 79 29 8462129 0,28 0,82 0,41 0,76 1984-01-17 79 36 8462141 0,06 0,45 0,39 0,30 1984-01-24 79 43 8462153 0,18 0,85 0,72 0,58 1984-01-31 79 50 8462165 0,74 0,66 0,27 0,56 1984-02-07 79 57 8462177

o,

71 0,64 0,14 0,50 1984-02-14 79 64 8462189 0,80 0,61 0,15 0,52 1984-02-21 79 71 84621101 0,28 0,71 0,02 0,34 1983-12-06 89 -6 835009 0,43 0,36 0,30 0,36 1983-12-12 89 0 835021 0,15 0,35 0,20 0,23 1983-12-13 89 1 835033 216 220 391 276 1983-12-14 89 2 835045 203 286 369 286 1983-12-15 89 3 835057 164 223 202 196 1983-12-16 89 4 835069 133 232 189 185 1983-12-19 89 7 835081 56 111 70 79 1983-12-22 89 10 835093 16 30 18 21 1983-12-27 89 15 835105 3,06 4,98 4,40 4,15 1983-12-30 89 18 835117 1,52 3,16 1,80 2,16 1984-01-03 89 22 846219 0,78 1,51 0,92 1,07 1984-01-06 89 25 8462121 0,44 1,41 0,96 0,94 1984-01-10 89 29 8462133 0,48 1,16 0,36 0,67 1984-01-17 89 36 8462145 0,22

o,

92 0,52 0,55 1984-01-24 89 43 8462157 0,32 0,88 0,56 0,59 1984-01-31 89 50 8462169 0,50 0,67 0,00 0,39 1984-02-07 89 57 8462181 0,83 0,76 0,10 0,56 1984-02-14 89 64 8462193 0,41 0,54 0,24 0,40 1984-02-21 89 71 84621105 0,00 0,48 0,05 0,18 1983-12-06 91 -6 835011 0,35 0,13 0,51 0,33 1983-12-30 91 18 835119 0,20 0,82 0,28 0,43 1984-02-21 91 71 84621107 0,22 0,65 0,15 0,34 8496.3 4

(7)

--

4

-Tabel 2. Bepaling van dienestrol in monsters urine.

Methode: Intern analysevoorschrift A 381, met gebruik van

antiserum RIVM-0646/0647 en radiolabel 3H-HEX

Datum Dier- Dag na RI KILT

monstername nummer behand. nummer Res 1 Res 2 Gemid.

J.lg/1 J.lg/1 J.lg/1 1983-12-06 75 -6 835001 0,13 0,00 0,07 1984-01-03 75 22 846211

• o,oo

0,15 0,08 1984-02-21 75 71 8462197 0,06 0,46 0,26 1983-02-06 78 -6 835003 0,91 0,09 0,50 1983-12-12 78 0 835015 0,00 0,00 0,00 1983-12-13 78 1 835027 650 816 733 1983-12-14 78 2 835039 319 315 317 1983-12-15 78 3 835051 276 201 238 1983-12-16 78 4 835063 208 224 216 1983-12-19 78 7 835075 55 62 58 1983-12-22 78 10 835087 60 62 61 1983-12-27 78 15 835099 9,45 6,55 8,00 1983-12-30 78 18 835111 9,52 12 11 1984-01-03 78 22 846213 18 10,63 14 1984-01-06 78 25 8462115 6,87 5,63 6,25 1984-01-10 78 29 8462127 5,63 5,91 5, 77 1984-01-17 78 36 8462139 10,50 3,32 6,91 1984-01-24 78 43 8462151 5,04 3,15 4,10 1984-01-31 78 50 8462163 10,39 4,44 7,42 1984-02-07 78 57 8462175 5, 92 1,19 3,56 1984-02-14 78 64 8462187 1,46 1, 77 1,62 1984-02-21 78 71 8462199 1,42 0,48 0,95 1983-12-06 85 -6 835007 1,24 0,42 0,83 1983-12-12 85 0 835019 0,00 0,30 0,15 1983-12-13 85 1 835031 924 834 879 1983-12-14 85 2 835043 742 590 666 1983-12-15 85 3 835055 300 256 278 1983-12-16 85 4 835067 200 180 190 1983-12-19 85 7 835079 182 129 156 1983-12-22 85 10 835091 13 20 16 1983-12-27 85 15 835103 18 13 16 1983-12-30 85 18 835115 17 19 18 1984-01-03 85 22 846217 11 10 10 1984-01-06 85 25 8462119 11 8,31 9,66 1984-01-10 85 29 8462131 2,58 4,95 3, 77 1984-01-17 85 36 8462143 6,04 6,59 6,32 1984-01-24 85 43 8462155 3,14 4,30 3, 72 1984-01-31 85 50 8462167 10,18 4,55 7,36 1984-02-07 85 57 8462179 1,40 1,33 1,37 1984-02-14 85 64 8462191 3,29 2,34 2,82 1984-02-21 85 71 84621103 6,07 1,14 3,60 1983-12-06 91 -6 835011

o,oo

0,05

o,oo

1984-01-03 91 22 8462111 0,97 0,00 0,44 1984-02-21 91 71 84621107 2,25 1,67 1,96

(8)

- 5

-4. Conclusie

Dienestrol bereikt ~ên dag na behandeling met dienestrolacetaat een

maximum. Na ongeveer 3 weken is het DE-gehalte afgenomen tot

+

10 ng/ml

en na 4 weken tot onder de 5 ng/ml.

Hexestrol bereikt voor dier nr. 79 na éên dag een maximum en voor dier

nr. 89 na twee dagen. Na ongeveer 2 1/2 week neemt het gehalte HEX

aanzienlijk af tot < 1 ng/ml.

5. Literatuu

1. De Ruig, W.G., Berghmans, M.C.J., Polman, Th.H.G.

RIKILT intern analysevoorschrift A 270.

Radio-immunochemische bepaling van diethylstilbestrol (DES) in run

-derurine na chromatografische voorzuivering met behulp van een

chromatolithe A kolom.

2. De Ruig, W.G., Polman, Th.H.G.

Radio-immunochemische bepaling van hexestrol (HEX) in runderurine

na chromatografische voorzuivering met behulp van een chromatolithe

A kolom.

Radio-immunochemische bepaling van dienestrol (DE) in runderurine

na chromatografische voorzuivering met behulp van een chromatolithe

A kolom.

4. De Ruig, W.G., Berghmans. M.C.J., Bruchem van, G.D., Polman, Th.H.G.

RIKILT rapport 84.6.

Uitscheiding van dienestrol en hexestrol in urine van met deze

mid-delen behandelde vleesstieren. Interim rapport.

5. De Ruig, W.G., Struijs van der, T.D.B., Weseman, J.M.

Hexestrol en dienestrol. Een literatuuroverzicht.

Bepalen van de titer en de specificiteit van het RIVM-DES-antiserum

0646/0647 en het Hoechst stilbeenantiserum 6139 met 3H-HEX of 3H-DE

als gelabeld antigeen.

(9)

8. Schema Intern Voorschrift A 380/381 HYDROLYSE/EXTRACTIE 0,2 ml URINE 0,25 ml ENZYHOPLOSSING

t

INCUBEREN 60'-37°C

l

0,05 ml 3H-HEX 1,0 ml ETHER

_.__

---

-VORTEXEN 15" CENTRIFUGEREN 2'-3000 rpm-4°C SNAP VRIEZEN

HATER

FASE

~ ~

THER

FASE

!

1,0 ml ETHER

t

VORTEXEN 15" CENTRIFUGEREN 2'-3000 rpm-4°C

l

DROOGDAl-fPEN

t

1,0 ml ISOO/ETAC 90/10

l

30' VORTEXEN KOLOHZUIVERING

.c---

-KOLOH BEVOCHTIGEN 3 ml ISO-OCTAAN

1

HONSTER OPBRENGEN NASPOELEN 1 ml ISOO/ETAC 90/10

l

ELUEREN: 4 ml ISOO/ETAC 80/20 4 ml ISOO/ETAC 60/40 STANDAARDEN 0,025 ml GLYCOLHENGSEL 0,01 ml STANDAARD 0 05 ml 3H-HEX I

1

DROOGDAl-iPEN

(10)

OPVANGEN 60/40 FRACTIE

SPLITSEN IN 2 x 2 ml

INDAMPEN

RIA STANDAARD/HONSTER ASB

0,05 ml HETHANOL, 10' VORTEXEN

0,375 ml RIA BUFFER, 5' VORTEXEN

0,05 ml METHANOL, 10' VORTEXEN 0,425 ml RIA BUFFER, 5' VORTEXEN

l

0,05 ml ANTISERUM INCUBEREJ 30'-37°C

;·

-

4·c

0,1 ml RECOVERYTELLING 3 ml SCINTILLATIEVLOEISTOF

~

VLOEISTOF SCINTILLATIE TELLER

l

RECOVERY TELLING

NB: Standaard: HEX dan wel DE

8496.7

1

INCUBEREN 30'-37°C 30'-4°C 0,4 ml RESTANT

1

0, 2 ml DCC INCUBEREN 5'-4°C

l

CENTRIFUGEREN 10'-3000 rpm-4°C

!

0,45 ml BOUNDTELLING 3 ml SCINTILLATIEVLOEISTOF

l

VLOEISTOF SCINTILLATIE TELLER

t

(11)

:·L' 1 . . 1 1 1. : .1 , 1 I !:I.IJ;Iit·~~~~~~~ 1 ï, 1 1!1 ~~~~ ~~~~ .i1 1 .·; •• :::. : I .. ~·, ·1! ,

I

!j ~·I

1

~~ -

1

l~-~~~~~ :~

1

.

1

ii'ï ~~~,

11

~

₁

·,·:··

1

,~

Ijl

i! liJ .I·· • I:: :· .· .. . 'I

1 .

I . • ol

1

:! .. :'!il :'!:·:; ~ I I

. . .I 'I i ,;,, I . ·,·::I' :I.',!' :1 ; I 'IJ:: 1'1 1 I ::,: ' .. ' ,· _.t!: _,,., _: _: _I I :J : ,' _:₁1· ' 1!:11

I

Ijl

!

i::'

','I ' . . _:_·.₁_:_. _:I !'1 _·_:_::i:_·_,_' _..I' _'_i

. 'li .. : .. '" ... :: :1!' :l jJ:II :1 . lil

I

lil 1j:i. !: . ,I .. . ·, ··I .... ·: jl 'I ,I i :·' : 11 ,I 'I

I

I ' ".. . ·:. ; I ·:::' : I ,' 1:.· I. : ,' ' 1" ,

. .. _'₁₁ _{'. :}JIJ _..'11_j!':· "_..' ._I. _" 'l I I ' ' I. [I •

I

I ' • I I,, . .. 'i' I ' I'' I ' ' . I ,,. 'I 1: ' • I I I' ' 'I I lil 11 ,I I' 'J'I II . ' ' [t ' I'' . I 0 ·I I 'I . . I'' . I I ; !',, • 'I .. . I 'I,., . . I

. ' .. I. ::I : . ::: Jl:, :1 j: i':: :

-

~

;

~i

'

~~ ~ ~

~

· :

\,

:

:lil

~

IJ' I t 11!: I 'Ij l':: :I:! ! :-. 'I: i .. i ·;:: :-: : I i I . 11

~~ Ij~

~

TI

_11

· ~-.

·i

r

:

:i: 11:.

I

~

I' il i

i

I' I liJi

~~

1:: i i' .I: i.. . .

·I:

11 . ': . !i

i

[

::

,1[ : ... : i.: : : :, : .

•i• •• ,j 1111'1 . ' 111' I Ij l', .. Ir

j

ll

~

I

"Ijl'

.

'

"

''11 . . I i I 11 11 I·JII· ' jlll 11' 11:1 'I 11 111 I' . ' Ij •lo I ! I'

I

;I ' " 11 . :' . ! i I i 11 .: i 11 i

i:

!j

i

J

\·:

.

:

i

ll[ii.

!

!i

I.

:lil I ! I liJ: :j I:

i

i:

i

: ..

I!

i!;

I ; i I

I!~

l

:

''

:

1· \ ; lil - I

1

1 !W

:

li

i

'I I

I! '

I

i!

i

I! ;·ll ' : ';: 11'

i

I

i' i! :::

!

:

!

I

i

I!

:

;

ij

::

:

!

:

'

.

:IJ fil. u rl iil 1 •. , HE X .. u :tsclü idiTn:gscurv s. dl!er:nr. :,

9 : ,

.

,

1 t

.

,

.

,1::

11,

!1::t :.ii .J : 1 11·11\ lill iJ: ·I. j.: ''i .:i : 1 :•. :: ·[· ·j ,, . , ...

.

..

.... "'

I

'

I

'

I

'"

..

,,

I'

I'~.

'I'

I .. I' ~""I "'"1''-ï::i '1"TI f-

n

r

-

.

;J ,.;. •

r

I'

"

11 '. '

· "'

.

_,,"i! : 'I ,.,, .... ... I' ....

lij i1: I I I

IT

·J! l:lj

ji

'

I

i

I .

'

I.

I

i '

11 lil d er,nr

·:

:l

p

9 .

1:-i+ I -:+ I I I !i: I il I liJ I I ·: 1 l:l[ 1;· l i : :i :!; !

!

:

1 !'·:. : ,·1 ..

i

i!

:,;·liJï : :jiHI

:

· 11~

11

!i

i

lil

i

.

i!Ji

'::1

':

!1

i!

I

i!~!

!!lil! ; 1!:111 il!ll

t~

ll

ili

·

I i :·,

f

I

i'lji

~l

llii

I

lil-

I

-

ll

I

;i

!i

· :!:

!I !

!I,

1'11 lH'

I

!'[I

!·~~

:l!i

,::! :

:

i

!:

i

!!

!

:;:r.·

:!!- ; .

;.;1:

I

~,,

ll:ltl!-s ___ I lil 11 lil iiilli:l "'

4~L.:.~

:u,

~,l.IL

,!W:m

lJ

I

,1_ I ol ' 11 ' 11 11: :J_ :l!J 11

~

t4r+

ll!.!j..:.;.,..;..-" "..!..

.:....:.:

1 ~:

!.0ll: .. : :.:.l . .

JI

TI

!'i:

jl'

i!Tijill .. i!

i

··

.I

T

I

I!

I lH! I 11:1 :':': '! :i· :1" ::i)

I

il'i I'

TI

.

I i i 1:11:

I!

n

I J: ·,:: ;:

Tfil;

I ' l!:iJÏiliJ!i:

:

ffi:

i·:: lllji :1

::

r

· ;

:!!linT. ::!)₀₀.!: ... :, 1:: !. :i:! ·:

I

i

I

lli .. !1:,' ·: ·: 1 . :! :::!I ,: ', 1 I, 1 1 1

i

:I i 11

!

1,

I,

!1 11 ·, Lll_l_ 1 1 · !·· , [1 I .l·:li,!:

J:.·

:·

1,. . ...

s

.

·:·

:.!. 1·: 1. ' . ..

- . ''. ''J "I ~:-: ·11 -~\ft ;-r: '"!!

l'il

'I' I lrr I" I '''I 17--;-

·::r

:-;

-:-:;-;~p:

--;,.i.

''

T

-~-,·

11 '

1'1 ' lljjlljjll I jiJ

I

'

I

i

I

'

fl

rr·j'

11 I '

-:wt+:--

:T[L

:il ;++-:-iTtiJ " --;' ----;,' ·-- ---:-;-· .. - -,.'' .~· ~~~~-·:

:ï

ï""

l

'i!' :;, : i!' i i::· '!, • ' '!; iJJ: 1 'j'j'jj1 I

I

I!J lil !l i ,L: I, , 1 ·i 1' . 1! :11 :lj'j ! '1 i I ijl Jli lil! i[ I

!f

I

'

:

•

Ijl ::·: i lil ', I!, 1il !:J• !, • I 1, · ' , , I 1'j :i rj'! 1: , 1' ' ,. i

I ""' I" . ' :,, .. , '" I I' . , ... LI'J I'" .... . . I , . , I Ij I

I

.I I I I' '

!I

...

'Tl I ' .. I I . . . , . • jl· 'I I I' I' ' . I . . 1-I • .. • • • I

' 1 jl" '"I' I ' •j 1''1 Ij ' ,ro , .. · j ' ' 1 I 'Ij Jl 'j 1 ''' '1 · 1 I' '" ., ' '•· 11'' 1 1 1 • · ''" ''"•I · 1

I"' " ''I' •· 1

' I ' 1' 'I I. lil' 11 I ' I "I I I I ' I' I I I I I ' I 11 • ' I ' " 1• .. ''I. . ' ' '" ''I ' .

t " t ,. + ' ' 111 I I , !I t I I • f I ' I I I+ I ji • ' I • • ' I 11 I : .. _1': ... ... :! .: . .. . .

-

.

,:

.

~

:: Ll·r:.! .!..." 1-L

-~~

!

-- ... : ... ... !: . •. : .:. .r ::.

~l~

·:l

li

·.

jiJ

:

!.~

..

"~

1

· J

~

I :JJiJ. ...

_ui

.

..

.

..

~

.

· !:::1

:

_

· ... !. ·-- . . : ... . .. : . .,.:!:- . ... .. ·: 1 ',,, '11' ,,

I

I' 11' I' . ' ' I ,, ' 11'. 1]1' ,f 11 • I 1"1 '1''11 I I' " ., '' ' i' ' I .. , ' ' .. ' ".' 1 .. I Ij I 1 ' I • I I

l!

'

I

I' I I I

I

..

,

'I I I

I

.. ,

.

'

I I I I ''!i ' . . . ' I ' ,, i'j ' ... , I ' . !!" ' ~ I I i· 'I" ' . . . . •' [I' 1, 'i 'I!, I •j IJ "' '· ' . I ' I " ' . I ,; .: ; ::: I ', : ',

,, .. !'t ' I ' ' • ' •11 Jl· .• 11 I . I I • I •lt ' I I . I • • • l , jl • • I ' I ' Ij • ' lol l i l I ' ij :

I

! I I

I

· :

·

I 11 · : · · : : 1' l1

I

1 111 . . : ! 1 r : : · I r· 1 · ,. •

!

1 11

I~

11 .. !

lil

·I

'

1!1· . 1 1 1 i

1 ~

1 1 !

~

I i 1 · · ·I :i liJ · : 1

i

1 11 i ! : 1 1 I ' , :; : · J. : 11 :

:~

:

~,·

, 1 1 · : · : , · . : I . ·1! ++ , j , 1 • •t 1 1 tI 11 + I! I • 1 1111 , I, Ier, 11

!

I 1 • , •1 1 •! .• ,r, ! , I, ! . . t · t• I ·lil.

~00

I .. . . .

I

j

I

i

111 m

·

[":'1-· ··--

J

.

r.

i

I

til

i!'

IJ

...1

Jj

I i

mr~ll

~

:

I

i

11.1-.

# ...

JI-... -1.

!lli

I

· I

i

t I ,. · · • : _,!! ... ...

l

..

l·

'

i

· ...

...

....

I . .. 111 I . ' . 11 ' .. jl

~

I .• . I' ''11 "I '"' I H- I ''1'1'

~

11 .. . ' ' I 'I ' . , '" • i'' lli, '11' " . IJ' 1 1 1 1 1 • • I I j I ' 1 ' • lt

l

f> I j • I 1 1 1 1 11 ' + t l 1 1 f r ~ I , I I • 1 1

: I ! 11 : . ,,

!

i

,

,~

.

J

.

!

,~

;

I·

~

!Ir

~

I

'

''I

~~

,

· !

,

; :

.

J!

!! :

:

l

· ~~

I : ,

·:

i

'

~~

r

:

i I 11''11'11,· I.

I

1: i !

ill

l

' :

i't

~

11 .

I

l

l~

:

~

i

!

.

:

I

:

'I! ,

!

il :

I'

~

,

li

l

i~

_I i i i : . : : . .. . ;

!l :

I ; : '

~

: i . I ti

I

! : : ; : . i ,

-<

! ! ! :-. 11 , ., .. ..

~

· ~

... ll

Ir·

I

I'

,

I,. J .. . I' . I . , !lli'li 'lil I I. ., '

t

l

I. !1 1.': ·I . I I , ' ,.1 I .: t: ... '· 11 I I. . , .. ' : ' : " : I : ~ I I ; I : I I I I l. I : : I : I I . ' " I I I I I + " I I I 'I I I I I I 1 : ; l I I I I : • + I t ' 1 I I 11 t t ' i I I : I i I : : ' I

... , ... IJ ,I ... n~~

·j:ll

I

,_" 1'j1'- ,._, '., ,, . :; ... I J: . il jl j j: ..

1 ·r

T"' r

1 -

I"' : ,J ... -·I ., . , .Ij: .. , 'I'' .... , ... .. . ... .

:. I':" '"I:, '':i .· 1':: t;,: ' .,,11: ! : .. ·: . 'Ir I 11 :1,:' ".I i I i . 111 1:'111 I I !1: .11'1:

i':

.

,

t: . ''•' . I I I·:: '' . I

; '1::1

I

'"

. ' .

i:

'1'11 I Ijl, !I 1: . ' ' ', ,l,,'lj I•

I'

I JJil I i :,:. I ,:· . I

I I

j

l''';

:11' i·' :1' :, 'I I

i' ,•

1•1 'I . I i :'1;, ,, ',' .

. ' :'' . ' I • : . . 'I I :: ' I I ' I': i I : :i I ' 'I 0': I I : '':. ''

I'

:

'I • ! ' Ij:'

lil

I

j

'I:

'

I . '. ... ' . 11 ' : : ' " I • ' •

.

: .

o

· o

I . i'l I,, .. ," "·: . . . r •• , ·J ,, ,, I· ,I· , I I. :11. i... ..J 1.·1 I . ,, ., .

I

• : : I ~ • I • I ' • ' I ! t I ll : I I ; : : I I I I I j I l I j t : I j I • I ' ' I ' I. I ' ~ ; 1 • : : I I • I l I " 1 • " . ' I ' I . . ' ' ' : .

....

.

t

..

·· ...

.

ii

1..

:j

]

T!

"

..

,

I'"

'

.,

..

,,..

,

...

· ·I

J

..

,. I[II.IJ

~~

Ir .

I

'

.J

·--

1

11

l

"

'j

ii

[J·

·r

..

.

..

I, I " "" I ,

i

·

1 .. , I" ... ... , . . ..

!!!I :: IIIJ' ,J

I.!,

I I . 11 ':1 ::•!! ''il '1

' 'I liJ '!

I

I'

Ijl •. 'I' I' 'I 11 'I I I I', .. , •: ;.' " i 1!'1 ' .

"• I I 11" ' ''. ' j I I "'IJ ' ''I' , ' Jl I ' IJ ''I ' j IJ I' . "i' 'I IJ'' '''I I ,J j•' r,

li

~

i!

IJ

!ii

i

J

i

i:

:l

'i

::!Ui~

~ ~

I

u

lij

il

~

ili

it:l

:;:!

I

Ji

!j'

IJ

d

I

'!

Ij

!

il

l!

l

il'

~

I

lijHili

~

l~

[;i

[I.Jii

I!

I

1 1JIIil;

!i

i

!

:li

l

\i

!

W

i

\!lllllii[ût ,,: ::, ! . I

rr,

6 I' jl Ij r 111 ! I

T

I.'

"

fl

:! lil ,: i . I: I ril I '

TIIT

I I I .. I

i

I

I I I I: i J, ' I ::11 ' ' :'Ij I' I ;IJ I :I: jl[ . 0 I 4_·_·L_~s:: _JI;,I 00:

:LL

..:w . .:.:l!tlmJ'

~

11 I i i 1

J..!l~l

l

:

,

~!~ ~J

-~

.L-:1

~

uJ

1

llli

-

1~.,

.

,~

11 11 1

~

-

.

:d:

.J~

: ~

~~

1 ~~.uh

:

~,~~1

~ ,

::._!:.1..:~!

:~~

~I

'

-~hl·

!

· :_

....

!

·'I' I':·:: . .

I

.iTfT, I ' I \I I ' I: :•:] : .. ''I ,, Ijl

r

I I· '!I' ,, 'j I [ ·:·11llll' ,.

I'

I

·I ·JI· !'r

f::

I '. . ' ,' :::t jl IJl :1,. I

I ' 'j"J 11 ~' ' I I !jo J J) I I I ' JJ' '' IJ

1

:1 I J I I ~~~~ I Jl J I I ' I ' JJI I J " • J ' •J

::·

~

.~~:

~

.~

~~~

1

1; :1:':

:~

1 :

,

~ r

~

~~~

-

J

I

lt

J

i

:~i

!i

iT

1!

~~~

~

1

w·l

~

11

1

111 11!: 11'1 ,:,

l

₁

1_!_!1

J;!i

1 ~

~~

.

!1!

₁

l1

i'~~~

~

:~

~

1~d

l'lll

l~

~

:~

:!ii

:

i!

:-::

i-1,

~

jmt·r i;·:

i:i

r

!.J

)il

:

~

f.:l ..

I._

::_

.

~~

,

til

i

~

-

~

~1

..

.

!illiill

· !

rrr+

illl. .

r

.

1 IJ 1

1

1 L ..

:1.1

I:

111

-l

l

1 l.d

11-ULllLr!_:___J.!.!_I . ...:·

.~l~d~

l_ . .. 1 .•

lj,::t::: ":r.ï '! '.. Ijl Ij\ jl lll jj· 1'1 11 J:lij llii ·Jfll' i!·

l"''i

I I l!i'jiJii lif'ij li i'[jl :. I' ... 'l ' .. i '!j i:ll ji''Tnt

l

i!i

1 _~

_·

_·:

:

;.:d

;i_·:·:!: l.l

1

1i

1

''1

~

,

~

.,,

,,j

!f!:

)

,

i,,

1 nmrl

r

rd,ii~,~

,,

~~~,

,,,

11 ,~,

1

~~

,

~

1;!1

,·m

~

1

11 ,

1 1 ,

ji

,

~.q

.

,i

j'l

.

~~

1

rr

11·

,~~,

~i!,·

,i:l

~·!

.~

· !

1 :::! :::@~''

₁

,1111

~

:

~

.

[

8i

~

:!~

r

oo

~

.I

.l.

f

· Ull

I

J

~~

-

'

~J

::!

.;j

·!11

l4)

U

.

I

j!l

li

.!J

i~

.

'

!I.

~·

:

I lJ

rw

.

I

i!

.

,

~+

L~

!

11

i\

211!

:J~

li.

:

L

I 'I

.

:J

U

..

JJ!

l

!L

L

.:JJ-

~:

:~

i!

I J liL I -

.

~:~:

!,:·

~

:

-

:.;:, ..

~

..

~

. !11,1 i . ,.

~~

~

11

Il.Q

~~·~

1 ~::

1

:t!illl:

~~~~

_{;· 1}·11111l:!·:

:'lilt'~,,

IJ 'wi

tt,·

~

· :! ~~

1 m

₁ , 1 .,.

~

nr

~.

11·1

i

· f, :

·

· ~

~~~~

.:.

1 ~

~:

!J!,· . .. I

.

:!:

.

:.

:

1·,1· 1 , .. 'I' ... , , ,, . . . " ' I

I

11 ~1"'.:._11 1 . .. Jlll ,, [11 ,J II ''! I'''' 1'1 1'1' ' jll ' :!,,.: 1, ,11111'11 IJ' •' ,, .. ,j ' '

:,· ... ·;· "!' ::· ' . I '

I

I : 0 11 lji~· i !"iJ': 1:11 I lj:l :J: 11 I . il I I i' : ,. ,.. " ,' ,1" " ' I I .

'j•

I ::Ij ,,1 . ·:1 ::: ";: : ' 1: I· · . .

I. G) 'I' I 'I . I 11 I I i 1!111 :~1 '11' 11 I I ' ' '.IJ ll I I ' I I 0 11 I I ' I' 11 I' ' lij I :I IJ !I' I 'I ' . I' ' ' I 11' . ' . :I I I I I

• .!.:t!J~ •. __ j : , 1:. :. •' I I 11 .

trrT'

:PI:: ... ~~~ I-Jl~ 'j ~I . ' . I I ijl' I ,:: . ~-

i

I~! :.!l! 4~;·

,_:

_

:;, ..

:'

:.:..

:

:ll:

~.1 J.!ll

'

11 '

1 !

..

I.. I

J!l1

:::

1

1 il'i

~

'

~

,

;

I ~i

TJ .

~~

~

nj!!

n,ry!

lj!J

~

!Ni

r

·~

T

~·

jl

1'11'111,:111~lfli[!lf

![til jjfj1 m I!'' [

l

i

d

~

~·

ji

~

· ~

:

:!1

rj·l[! llill''

w~·~

f!f:

ilil'

l

~·::

!;i!

!lj'l

i~

~

!j!flllfli!:! :i;!l

.lt ....

····liH

~

..

j .. l ,, Ij . '

'

I

t-1- i-J

i

~

'

I •I .:i!l ·I

'

I

I '

I

AA

I

I :1! I!'

I~

. Ij '11 1':1 I' I,, ... , .. '11 :jl" 'J•I I ,[l,l ... ,

j!:

i

.::.

1

Ö

d

~

:

J:

i

I!

i

il I!

I!

l!ii i:!l

li.

T

:

~

· ~

L

LJ.t

i;:,

llil

,

'

I! I 111·. I I I I ' I I

1.

1

!

I

lU]

'!H I ' I

L

~lJ-~!-,!

~

[1 I!! 1:!:

.J.l

U

!

~

'I' ' 1 ' ' ' ' ' ' " "'i • • ' "lo I I I i ' " 11 lo 'o ~f-l-j •• • '''~' , o '' I;-'· . • •

:.:: •. :· : I I jl :: !jl 1 ,•:! !1" ; · ,• •••

~

:

•

I'

~

·

i' r:w.,lli i!!J

~

I

J

tlli

~

oi[J_,, jl li l 11 I IJ IJ;,h I I.! Til( 11 :1 ', . I ,, '·:f·l :1 'l'i I I: 0

: •• ' · :.' ,_

+. • I t • 11 I! I 1 I • ' I I'. ,, I •• , j "' l:!

l!

I

rr:

• I ' I Ij • 1 't.l1 ,I I t t • j I .. I I' I' 11 ' I • I• • • ! ' . ·' '

: ·:. . ..J . /.' .1 !'I I!:·: l1 11.1

1 :

!~~

· ;;

. : ... ··'·j;·

,

~

. .·,: ''il[[l:

l

~l~

~

...

!

.

d

l~

t ₁₁-/ 1 lil

J

·I\

:"

I

WI

1· .. , 1 l 11 l·j1[ 1 . 1 .... 1 .. -₁1.il

~-

~

111. . .,. :. . . 1.

· .:

~

..

,J:· . . I· li!il jll'' ' 11 1'1 . ,,,,JI ,,, I .... ~ ·llj··J'I I' lj jlt l!lllllltl .. -;":~ I IJ ,,,:

J

I I I 'I I Ij I ... I ,: .. 1·,. Ij' • 0 1[ •.•

;-i:i : .. ::~:i--: :~l-:-l+H-;..!.!qr ~: _____:_! :...:: .:.:~~

...L.-r:·

.

....

: .:

..

J:r.i ..

..U!

.

1 1; : _: _ ,· :::: 111: i;"' t::

:

Tq

~~l! .J~ ...:.:₄ _: ·: ..

!!·l

;:

J

....

1., ... ! ._::.~~1: ._:·1:1.'

G.j

:

.. :

.::.! ... : ::: • ··

!, ~ • ::· .;. i ·Ij ll!l i!: ,, .. jil, 'lil

:>

1 ,.· i1jl li! :,J~ .. I,. I:: ~~~!1:~~·).111il, 'j!J JI','

I

;

:;

!

!!IJII I ~r:-!

·lT!

!I ' ,,, '; ' ': j: !··: :1 : lii ' ·;:, . 'I Ij, .. if:l::l: ' . .. I ~·

+ t ' I . ,j.! . ' I•' '" I' I 1 .. . . I . ' I ' I I •I +. I l . I ! I • .~ H I~ I I I 11 . • ' I I I +I ' •I ' ' I

.. _Jl:,_•,:·.· ::::,·

'l

"!'!

'

:l'~

·

· ·;·

l

r

':

'111 .. ... 1, ..

-:~.

1- ..

,

.,,!.~~,

~

'

~~

~

.

..

~

,~~~~~f~

~~~

.

m,,

,

'

llli

l

ll[

l

l,

~,

.,.~~:;!

,

..

~,. ,~,

.

i:''i.

.

I ·.· .; I.J.'·'·

I

•1 "'i I • 1,1 I Ijl· j IJl j•j

'I

·

I 1: ·.I • • j • J• I: ljiJ~ IJ• I t'n ~r.-.

;

.JU:

,

• lJ

1 j [I jl• IJijJfi'r ~ r, • !1 1 Ij I' I I , .· , 1'1

!..~·: ;;:_; :_:~: :._, 1 ' !l~l 1_1:

,I 1ol I I . :J : il1 1 •:.1 1• • lt ! t•l !.1 1:1 ···til I,,:, :::t llilti:.J~ llt'• 1111 I : llt ~! 11111~ I 1 1 1 : l: :t I I ! . . . I : jl