UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.uva.nl)
UvA-DARE (Digital Academic Repository)
Genetic profiling of the peripheral nervous system
de Jonge, R.R.
Publication date
2003
Link to publication
Citation for published version (APA):
de Jonge, R. R. (2003). Genetic profiling of the peripheral nervous system.
General rights
It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s)
and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open
content license (like Creative Commons).
Disclaimer/Complaints regulations
If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please
let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material
inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter
to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You
will be contacted as soon as possible.
168
S a m e n v a t t i n g
De perifere zenuw bestaat uit zenuwvezels (axonen genoemd) die omgeven worden door Schwann cellen. Schwann cellen omwikkelen hierbij de axonen zodat er een vetlaagje ontstaat dat ervoor zorgt dat de zenuwimpuls efficiënt kan worden voort-geleid. Dit vetlaagje wordt myeline genoemd. Patiënten met een demyeliniserende neuropathie, een ziekte waarbij dit myeline laagje wordt afgebroken, hebben impuls-geleidingsstoornissen, zowel in motorische als in sensorische zenuwvezels, waardoor krachtsverlies en gevoelsstoornissen optreden. Deze ziektes kunnen zowel aan-geboren (erfelijk) als verworven zijn. Myeline is een morfologisch ingewikkelde een-heid, die bestaat uit compacte en niet-compacte delen. Elk van deze delen bevat een specifieke set eiwitten en vetten om de myeline laag te vormen en te onderhouden. Het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek is om genen te bestuderen die betrokken zijn bij de aanleg van het myeline, het onderhoud van het myeline en de interacties tussen het myeline en de axonen. Bovendien zijn we geïnteresseerd in genen die betrokken zijn bij het ontstaan van demyeliniserende neuropathieën. Het vinden van dit soort genen kan uiteindelijk een bijdrage leveren aan de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
O m dit doel te bereiken is het onderzoek opgedeeld in twee onderdelen. In het eerste deel w o r d t aan de hand van genetisch koppelingsonderzoek de oorzaak van de hereditaire motorische en sensorische neuropathie-Lom (HMSNL), een autosomaal recessief overervende neuropathie, gekarakteriseerd. In het tweede deel, is een expressie profiel van de gezonde zenuw en gekweekte Schwann cellen afkomstig van controles en patiënten gemaakt. Hiervoor is gebruik gemaakt van serial analysis of gene expression (SAGE) en arrays.
Een literatuuroverzicht in Hoofdstuk I belicht de structuur, compositie en ontwikkel-ing van de myeline laag. Deze algemene introductie bespreekt bovendien de verworven en erfelijke demyeliniserende neuropathieën en het proces van degeneratie en regeneratie van de myeline laag.Tot slot is er een uitleg over de gebruikte moleculaire technieken: SAGE en microarray.
Hoofdstuk 2 beschrijft een in vitro kweekmodel voor myelinisatie. Er zijn veel aan-wijzingen dat het axon ook een belangrijke rol speelt in de pathogenese van de erfelijke en verworven demyeliniserende neuropathieën. Schwann cel-axon interac-ties lijken van belang voor het verloop van de ziekte en het herstel van de patiënt. Tot op heden is het niet mogelijk geweest deze interacties in vitro te bestuderen met de hulp van humane Schwann cellen en humane neuronen. Het axon moet namelijk van een bepaalde dikte zijn, wil het omwikkeld (gemyeliniseerd) worden door de Schwann cel. Het doel van deze studie is de juiste kweekcondities te vinden die de
Sammenvatting 169
g r o o t t e van de d i a m e t e r p o s i t i e f kan b e ï n v l o e d e n . I - m e t h y l - 3 - i s o b u t y l x a n t h i n e en f o r s k o l i n , f a c t o r e n die h e t c A M P niveau v e r h o g e n , en Schwann cel g e c o n d i t i o n e e r d m e d i u m z o r g e n v o o r d i k k e r e z e n u w u i t l o p e r s . c A M P staat er o m bekend d a t het de expressie van myeline genen in Schwann cel v e r h o o g d . c A M P kan o o k b e t r o k k e n zijn bij een s i g n a l e r i n g s r o u t e die myeline geassocieerde v e r a n d e r i n g e n in de z e n u w u i t -l o p e r s v e r o o r z a a k t .
In H o o f d s t u k 3 en 4 b e s c h r i j v e n w e de k a r a k t e r i s e r i n g van h e t gen dat de o o r z a a k is van H M S N L , een a u t o s o m a a l recessieve n e u r o p a t h i e . H M S N L is als eerste g e c o n s t a -t e e r d o n d e r Bulgaarse zigeuners. La-ter is de z i e k -t e o o k g e v o n d e n bij a n d e r e Europese zigeuners. H M S N L p a t i ë n t e n h e b b e n behalve een Schwann cel d y s f u n c t i e o o k al v r o e g a x o n a l e s c h a d e . D i t s u g g e r e e r t d a t v e r s t o o r d e a x o n - S c h w a n n c e l i n t e r a c t i e s e e n g r o t e rol spelen in de pathogenese. H e t gen bevindt zich op de q a r m van c h r o m o s o o m 8. In H o o f d s t u k 3, is h e t o o r s p r o n k e l i j k e H M S N L gebied van 3 c M , een maat v o o r D N A afstanden, d o o r m i d d e l van r e c o m b i n a t i e m a p p i n g en een m i n i m a a l g e b i e d van h o m o z y g o t i e , t e r u g g e b r a c h t naar o n g e v e e r 200 kb. In H o o f d s t u k 4 l e v e r t s e q u e n t i e analyse van t w e e genen in het gebied de m u t a t i e o p die l e i d t t o t H M S N L .
D e m u t a t i e in het gen N - m y c d o w n s t r e a m - r e g u l a t e d gene I (NDRGI) v e r o o r z a a k t een v r o e g t i j d i g e s t o p in h e t afleesraam van het D N A w a a r d o o r h e t e i w i t n i e t geheel gemaakt kan w o r d e n . D e m u t a t i e e r f t o v e r m e t de z i e k t e en k o m t n i e t v o o r o n d e r de n o r m a l e b e v o l k i n g . D e precieze r o l van h e t NDRCI e i w i t in de p e r i f e r e z e n u w is o n b e k e n d . U i t v o o r a f g a a n d o n d e r z o e k is b e k e n d dat NDRGI een r o l s p e e l t in g r o e i a r -rest en c e l d i f f e r e n t i a t i e . NDRGI z o u d a a r o m een r o l k u n n e n spelen als signaal e i w i t tussen c y t o p l a s m a en de nucleus. In o n z e s t u d i e is g e v o n d e n dat NDRGI t o t expressie k o m t in de p e r i f e r e z e n u w ; er zijn m e t name hoge niveaus d e t e c t e e r b a a r in de Schwann c e l . D e c o n c l u s i e is dat NDRGI een r o l s p e e l t in h e t p e r i f e r e z e n u w s t e l s e l en misschien zelfs in Schwann cel signalering die noodzakelijk is v o o r axon overleving.
O m een e x p r e s s i e p r o f i e l van z e n u w en g e k w e e k t e cellen te k r i j g e n zijn in H o o f d s t u k 5 t w e e SAGE banken gemaakt. SAGE is een t e c h n i e k w a a r b i j in een keer alle genen die t o t e x p r e s s i e k o m e n in een bepaald weefsel k u n n e n w o r d e n b e s t u d e e r d . Een f r a g -m e n t van 10 basenparen is g e n o e g o -m een gen te i d e n t i f i c e r e n . H e t i s o l e r e n van d u i z e n d e n van deze f r a g m e n t e n geeft een k w a n t i t a t i e f o v e r z i c h t van t o t expressie k o m e n d e g e n e n . In deze s t u d i e zijn SAGE banken gemaakt van de n o r m a l e z e n u w en g e k w e e k t e Schwann cellen. D e genen die het h o o g s t t o t e x p r e s s i e k o m e n in beiden banken w o r d e n v e r g e l e k e n en b e s p r o k e n . D e genen zijn in v e r s c h i l l e n d e f u n c t i o n e l e g r o e p e n g e c a t e g o r i s e e r d . T w e e s t a t i s t i s c h e m e t h o d e n z i j n g e b r u i k t o m z e n u w -specifieke genen te o n t d e k k e n . In de z e n u w v o n d e n w e m e t name g e n e n die b e t r o k k e n zijn bij het v e t m e t a b o l i s m e , het c o m p l e m e n t s y s t e e m en de celcyclus. D e g e k w e e k t e Schwann cellen b r e n g e n v o o r n a m e l i j k genen t o t expressie die b e t r o k k e n
zijn bij het aanmaken van de extracellulaire matrix. De bekende myeline genen kwamen niet hoog t o t expressie in deze SAGE banken. Deze gen expressieprofielen zijn te gebruiken voor de identificatie van genen en eiwitten die betrokken zijn bij het onderhoud van de myelinelaag en bevatten kandidaat-genen die betrokken zijn bij erfelijke neuropathieën.
In Hoofdstuk 6 w o r d t één categorie van genen nader bestudeerd die hoog t o t expressie komt in de SAGE bank beschreven in Hoofdstuk 5. Het gaat om de genen van het complement systeem. Het complement systeem, is een systeem dat betrokken is bij het afweersysteem. Het systeem werkt in een cascade waarbij stap voor stap eiwitten worden geactiveerd om ervoor te zorgen dat via het "membrane attack complex" ongewenste eiwitten of bacteriën verwijderd worden. Het systeem bestaat uit ruim 30 eiwitten en kan via twee routes zijn werk doen.
Tijdens het bestuderen van de SAGE bank van de zenuw is een hoge representatie van deze genen gevonden. In de zenuw zijn zowel de activerende als de remmende factoren van het complement systeem aanwezig. De perifere zenuw is dus in staat zelf een aantal componenten van het complement systeem te synthetiseren. De eerste componenten van de complement cascade zijn gevonden in het axon, terwijl de rem-mende factoren zich bevonden aan de buitenzijde van de zenuw. In een zenuw-crush experiment, dat model staat voor zenuwdegeneratie, zijn geactiveerde complement eiwitten gedetecteerd. Hieruit is de volgende hypothese opgesteld: de lokale productie van complement in het perifere zenuwstelsel is nodig voor het effectief wegruimen van de myeline laag na schade. D i t is een voorwaarde voor regeneratie van de zenuw.
Hoofdstuk 7 beschrijft een array experiment. Een array is een filter of een glaasje waarop bestaande genen geplaatst zijn. Door de array te hybridiseren met comple-mentair D N A kan het expressie profiel van een bepaald weefsel waarvan het D N A afkomstig is worden bepaald. De array in deze studie bevat genen die hoog t o t expressie kwamen in de SAGE banken uit Hoofdstuk 5. Aanverwante genen van de hoog t o t expressie komende genen zijn ook toegevoegd, evenals genen die zich in dezelfde biologische route bevinden. De array is gebruikt om verschil in expressie te kunnen aantonen tussen normale Schwann cellen en Schwann cellen afkomstig van patiënten met een neuropathie. De verschillende samples zijn vergeleken en 42 genen waren verschillende gereguleerd tussen de gezonde en de van patiënten afkomstige Schwann cellen. De locatie van de genen op het chromosoom is vastgesteld en twee genen liggen in een gebied wat gekoppeld is aan een erfelijke neuropathie. Deze genen zijn kandidaat genen voor HMSN en zullen verder geanalyseerd moeten worden. De genen die een verschil in expressie vertonen zijn met name betrokken bij de extra-cellulaire matrix formatie, celgroei, ontwikkelingsprocessen, spiercontractie en vetmetabolisme. Een aantal neurotrofe factoren, waarvan reeds beschreven is dat zij
betrokken zijn bij zenuwdegeneratie, worden ook verschillend t o t expressie gebracht. Grote verschillen in het expressie profiel van de normale versus de uit de patiënt gekweekte Schwann cellen zijn niet aanwezig, daarvoor hebben we een SAGE bank gemaakt van Schwann cellen van een HMSNL patiënt en die vergeleken met de nor-male Schwann cell/SAGE bank uit Hoofdstuk 5.Tussen deze SAGE banken zijn eveneens weinig verschillen te zien. De verschillen in gen expressie gevonden met de array zijn ook terug te vinden wanneer de twee SAGE banken vergeleken worden. Omdat de array uit een geselecteerde set van genen bestaat vinden we meer genen die verschillend gereguleerd zijn wanneer de SAGE banken worden vergeleken. De belangrijkste verandering in genexpressie is de opregulatie van het gen Semaphorine 3C. Semaphorine 3C is waarschijnlijk betrokken bij het sturen van de axonale uit-groei. Bovendien is het betrokken in het controleren van de migratie van neurale crest cellen in hart weefsel. Er moet nog veel onderzoek gedaan worden om deze data te bevestigen en de functie van de verschillend t o t expressie komende genen te ontrafelen.
Het proefschrift eindigt met een algemene discussie (Hoofdstuk 8).
Samengevat hebben we meer inzicht gekregen in het genexpressie patroon van de normale zenuw en van humane Schwann cellen van zowel gezonde controles als patiënten met een erfelijke neuropathie. Een opvallende observatie is de aanwezig-heid van genen van het complement systeem. De resultaten van dit proefschrift kunnen leiden tot de vondst van meerdere kandidaat genen voor erfelijke demyeliniserende neuropathieën. Dit kan uiteindelijk leiden tot mogelijke, nieuwe behandelingen voor de erfelijke neuropathieën.
