Opening new doors: Hedgehog signaling and the pancreatic cancer stroma - Annex

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Opening new doors: Hedgehog signaling and the pancreatic cancer stroma

Damhofer, H.

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2015

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Damhofer, H. (2015). Opening new doors: Hedgehog signaling and the pancreatic cancer

stroma.

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AnneX

summary

nederlandse samenvatting

deutsche Zusammenfassung

Acknowledgements

Curriculum Vitae

portfolio proefschrift

List Of publications

&

sUMMArY

Communication between cells by means of extracellular signals is essential for the proper organization and function of multicellular organisms. These signals decide where a cell needs to migrate to, into which cell- or phenotype they should differentiate, or if they should proliferate, survive or undergo programmed cell death. However, deregulations of signals and pathways affecting these cellular processes are key players during malignant transformation and progression. One signaling pathway that can orchestrate all these functions and is indispensable during embryonic development but also found very frequently aberrantly activated in different malignancies, is the Hedgehog (Hh) signaling pathway. In pancreatic cancer, a very difficult to treat tumor type with a very poor prognosis, Hh ligands are produced by tumor cells and signal to the surrounding tumor microenvironment, which was shown to have tumor promoting functions. Several drugs targeting this stromal compartment are currently in clinical development. One of the main cellular components of the tumor microenvironment, also called tumor stroma, are fibroblasts that get activated by signals from the tumor cells such as Hh. The research in this thesis aimed to gain new insight into different layers of the regulation of Hh signaling and the stromal response in pancreatic cancer.

How cells respond in different ways to Hh ligands is only poorly understood. In chapter 2 of this thesis we explore the relevance of the primary cilium for the non-canonical migratory response in fibroblasts. We describe that ciliary-localization mutants of Smoothened (Smo) use different intracellular trafficking routes compared to wild type protein and as a consequence show different glycosylation status. These mutants furthermore are unable to mediate the transcriptional Hh response but show improved chemotaxis towards Hh ligands as well as chemical Smo agonists. As a next step we investigated chemotactic Hh signaling in cells with defective ciliary function as a consequence of genetic perturbation in intraflagellar transport proteins that are essential for the formation and maintenance of the primary cilium. Corroborating the previous observation in Smo mutants, cells with defective cilia showed enhanced chemotactic signaling towards Smo agonists but lacked a transcriptional response. Interestingly, Smo with impaired ciliary localization enhances neurite outgrowth, extending these findings beyond fibroblasts to a more developmentally relevant model system. In summary this study shows that localization of Smo to different cellular compartments, especially the primary cilium, can separate the signaling output into transcriptional (cilia-dependent) or migratory (cilia-independent).

As mentioned above, pancreatic cancer is a difficult malignancy to treat and failures of clinical trials were in part attributed to a lack of preclinical models reflecting the heterogeneity found in patients. In chapter 3 we show the establishment of a tissue biobank of pancreatic and esophagogastric cancer patients undergoing surgical resection at the Academic Medical Center Amsterdam (AMC). We describe the extensive collection of tissue and the establishment of patient-derived xenograft models as well as primary cell lines. As an example we compared the expression of Hh ligands in these models

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and found that Hh expression is conserved between patient tumor, xenograft and cell line and that pancreatic cancer cells are generally more potent to signal to stromal cells compared to cells derived from esophagogastric patients. These tools will greatly aid in future research to develop and test new treatment regimens and to gain better insight into the pathobiology of these diseases.

In chapter 4 we look into new mechanisms of Hh ligand spreading from tumor cells. We define the role of ADAM metalloproteases in the release of Hh from pancreatic cancer cells. By performing knock-down experiments we show that blocking the release of Hh proteins leads to an accumulation of protein on the surface and decreased signaling capacity of the supernatant. Interestingly, we observed that this was accompanied by an increase of signaling potency and range in direct coculture experiments using a newly developed reporter system, suggesting a prominent role of cell-bound Hh molecules in activating the pancreatic cancer stroma.

Which stromal factors are produced in response to Hh ligands from pancreatic cancer cells remains largely unknown. In Chapter 5 we use a new coculture system in combination with species-specific next-generation sequencing to identify Hh-regulated factors that are able to signal back to tumor cells and potentially aid in disease progression. We describe 35 genes coding for extracellular proteins that were downregulated after Hh blockage and highly upregulated in pancreatic tumor tissue compared to normal pancreas. High expression of several of these genes was associated with poor clinical outcome, making them interesting targets for further mechanistic and biological studies.

In chapter 6 we put our focus on one specific gene and show that the metalloprotease ADAM12 is overexpressed in pancreatic cancer tissue and associates with poor clinical outcome. By molecular profiling of patient-derived xenografts (described in chapter

3) we found that ADAM12 expression is mainly derived from the stromal cells both on

transcriptional level, but also stainings of patient and xenograft tissue as well as flow cytometric analysis revealed the stromal origin of ADAM12 expressing cells. By performing correlation studies on gene expression profiles, we found strong positive correlation of ADAM12 expression with typical genes expressed by stromal fibroblasts such as collagen, alpha- smooth muscle actin and SPARC, and negative correlation with ductal marker cytokeratin 19 and the tumor percentage score of the respective tissue used for profiling. Fitting with this observation is the fact that genes specifically upregulated in the pancreatic stroma as well as extracellular matrix genes are found to be highly enriched in tumors with high ADAM12 expression, suggesting ADAM12 as a useful biomarker for stromal activation status and overall stromal content of patient tissue. Furthermore, we provide evidence that ADAM12 expression can be induced by tumor derived signaling molecules, such as TGF-

β

. To address the potential of ADAM12 as a biomarker, we measured ADAM12 in the serum of pancreatic cancer patients and found this protein elevated compared to healthy volunteers. We did not observe a significant association of ADAM12 levels with clinical parameters such as age, gender, or stage. However, high circulating ADAM12 levels predicted poor clinical outcome in this patient cohort.

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In conclusion, this thesis gives new insights into different aspects of stromal biology and

Hh signaling by addressing questions like how the migratory response in fibroblasts towards Hh is mediated, how metalloproteases influence Hh release from pancreatic cancer cells, which genes are activated in response to Hh ligands in the pancreatic cancer stroma and how ADAM12 can potentially be used as a serum-borne stromal marker in pancreatic cancer patients. This thesis therefore spans a wide spectrum of translational research from very basic signaling mechanisms (chapter 2 and 4), to stromal tumor biology (chapter 4 and 5), development of new pre-clinical model systems (chapter 3) and potential clinical applications of a serum-borne biomarker in pancreatic cancer patients (chapter 6). Work provided here will aid future research efforts to gain more detailed insight into mechanisms of Hh signaling, the complex tumor-stroma crosstalk and the consequence thereof on tumor biology.

&

nederLAndse sAMenVATTing

De communicatie tussen cellen middels extracellulaire signalen is onmisbaar voor de organisatie en het functioneren van meercellige organismen. Deze signalen bepalen bijvoorbeeld waar een cel naartoe moet migreren, in welk cel- of fenotype ze moeten differentiëren, of proliferatie gewenst is en of ze moeten overleven of juist geprogrammeerde celdood moeten ondergaan. Verstoring van deze signalen en de cellulaire responsen hierop zijn helaas ook betrokken bij maligne transformatie en progressie naar kanker. Eén van deze signaaltransductieroutes die essentieel zijn voor de ontwikkeling van het embryo, maar die helaas ook een rol speelt in verschillende vormen van kanker, is die van de zogeheten Hedgehog (Hh) eiwitten. Deze Hh eiwitten zijn bijvoorbeeld geactiveerd in alvleesklierkanker, een moeilijk te behandelen vorm van kanker met een zeer slechte prognose. In deze ziekte worden de Hh eiwitten door de tumorcellen geproduceerd die zelf doof en blind zijn voor dit eiwit. De functie van Hh ligt in het stimuleren van cellen in het omringende weefsel dat niet uit kankercellen bestaat; het stroma. Dit stroma, en de activatie ervan door Hh eiwitten, heeft vermoedelijk een tumorbevorderende functie en een groot aantal geneesmiddelen die specifiek deze niet-kankercellen remmen zijn momenteel in (pre)klinische ontwikkeling. Eén van de belangrijkste specifieke cellulaire componenten van het stroma die geactiveerd worden door signalen van de tumorcellen zoals Hh, zijn de fibroblasten. Het onderzoek in dit proefschrift heeft als doel nieuwe of betere inzichten te krijgen in de verschillende lagen van de regulatie van Hh signalering, en de stromale reactie op dit eiwit, in alvleesklierkanker.

Cellen kunnen op verschillende manieren reageren op Hh eiwit, of ligand, maar over de manier waarop dit gebeurt is nog niet veel bekend. In hoofdstuk 2 van dit proefschrift beschrijven we de relevantie van het primaire cilium voor wat de non-canonical migratoire signalering in fibroblasten genoemd wordt. We tonen aan dat mutante vormen van de activerende receptor voor de Hh signaaltransductieroute, Smoothened (Smo), die niet in het primaire cilium kunnen komen een andere intracellulaire lokalisatie en daardoor andere post-translationele modificaties dan het gewone Smo eiwit hebben. Het gevolg hiervan is dat deze mutante vormen van Smo niet meer in staat zijn de expressie van genen te activeren, maar dat cellen met deze mutant wél een verbeterde migratie naar bronnen van Hh ligand en Smo agonisten laten zien. Ook beschrijven we de migratoire Hh signalering in cellen waarin de ciliaire functie verstoord is doordat een gemuteerde variant van intraflagellaire transport eiwitten, die cruciaal zijn voor het vormen en behouden van primaire cilia, tot expressie komt. Deze proeven bevestigen de observatie in de Smo mutanten; cellen met defecte cilia vertonen verbeterde migratie naar Smo agonisten, maar zijn niet in staat Hh-gedreven genexpressie te activeren. In een model voor neurale ontwikkeling laten we zien dat cilium lokalisatie mutant Smo ook resulteert in een verbeterde projectie van neuronen, wat suggereert dat de migratoire Hh respons niet uniek is voor fibroblasten. Samenvattend laten de bevindingen in dit hoofdstuk zien dat de lokalisatie van Smo in verschillende cellulaire compartimenten (vooral het primaire cilium), de gevolgen van de activatie van Smo kan scheiden in een migratoire respons versus de activatie van genexpressie.

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Zoals reeds vermeld, is alvleesklierkanker een moeilijk te behandelen maligniteit en de mislukkingen in klinisch onderzoek naar deze ziekte zijn gedeeltelijk toegeschreven aan een gebrek aan goede pre-klinische modellen die de heterogeniteit in patiënten weerspiegelen. In hoofdstuk 3 beschrijven we de oprichting van een biobank voor alvleesklier- en slokdarmkanker patiënten die een chirurgische resectie in het AMC hebben ondergaan. We laten zien hoe de uitgebreide verzameling van weefsel tot stand kwam, maar ook hoe dit weefsel gebruikt werd voor het maken van muismodellen voor tumoren uit patiënten (xenotransplantaat), en de daarvan afgeleide primaire cellijnen. Als voorbeeld voor de processen die met behulp van onze biobank bestudeerd kunnen worden, vergelijken we de expressie van Hh liganden in de verschillende modellen en laten zien dat Hh expressie geconserveerd is in de tumor van de patiënt, de in muizen getransplanteerde tumor, en de cellijn. Cellen uit alvleesklierkanker laten een sterkere expressie en signaleringscapaciteit van Hh ligand zien dan slokdarmkankercellen, maar we laten ook een hoge mate van conservering van Hh signalering in beide tumoren zien. Deze modellen kunnen een enorme bijdrage leveren aan toekomstig onderzoek naar het ontwikkelen en testen van nieuwe behandelingen, en kunnen daarnaast een beter inzicht geven in de biologie die aan deze ziekten ten grondslag ligt.

In hoofdstuk 4 bestuderen we nieuwe verspreidingsmechanismen van Hh geproduceerd door tumorcellen. We kijken hierbij specifiek naar de rol van de zogeheten ADAM metalloproteases in de afgifte van Hh eiwitten door alvleesklierkankercellen. Door gebruik te maken van RNA interference gericht tegen de ADAM eiwitten konden we aantonen dat het blokkeren van de afgifte van Hh-eiwitten leidt tot een opeenstapeling van Hh op het oppervlak, en logischerwijs een verminderd signalerend vermogen van het medium van deze cellen. Interessant is dat dit ook gepaard gaat met een toename van signalerend vermogen in door ons ontwikkelde modellen waarin directe tumor-stroma interactie gemeten wordt. Dit wijst op een belangrijke rol voor celgebonden Hh moleculen in het activeren van het stroma in alvleesklierkanker.

Het is grotendeels onbekend welke stromale factoren in alvleesklierkanker geproduceerd worden in respons op de Hh liganden van de tumorcellen en hoe deze weer terug signaleren naar de kankercellen.

In hoofdstuk 5 beschrijven we de ontwikkeling van een tumor-stroma celkweekmodel dat in combinatie met species-specifieke next generation sequencing geschikt is om de communicatie tussen deze twee compartimenten te ontrafelen en de Hh-gereguleerde factoren die mogelijk van belang zijn bij ziekteprogressie aan te tonen. We identificeren 35 Hh-afhankelijke genen die coderen voor extracellulaire eiwitten, en die sterk verhoogd tot expressie komen in alvleesklier tumorweefsel in vergelijking met normale alvleesklier. Hoge expressie van enkele van deze genen is sterk geassocieerd met een slechte klinische uitkomst, waardoor ze interessante doelwitten zijn voor verdere onderzoeken.

In hoofdstuk 6 concentreren we ons op één specifiek gen, en laten zien dat de overexpressie van metalloprotease ADAM12 in alvleesklierkankerweefsel een slechte klinische uitkomst voorspelt. Door uitgebreide profilering van uit patiënt verkregen tumormodellen

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(beschreven in hoofdstuk 3) vonden we dat ADAM12 voornamelijk tot expressie komt in

de stromale cellen en niet in de tumorcellen. Gebruik makend van genexpressie profielen vonden we een sterke positieve correlatie van ADAM12 met genen die de aanwezigheid van stromale fibroblasten verraden zoals collageen, alfa-smooth muscle actin en SPARC, en een negatieve correlatie met het tumorcel specifieke eiwit cytokeratine 19 maar ook met het percentage tumorcellen. Deze bevindingen werden bekrachtigd door de waarneming dat groepen genen die specifiek hoog tot expressie komen in het stroma en de zogeheten extracellulaire matrix in hoge mate verrijkt zijn in tumoren met hoge ADAM12 expressie. Verder tonen we aan dat ADAM12 expressie kan worden geïnduceerd door tumorcel-geproduceerde eiwitten zoals TGF-

β

. Dit alles suggereert dat ADAM12 een nuttige biomarker voor zowel het percentage stroma in de tumor alsmede de mate van activatie van dit stroma zou kunnen zijn. Om het potentieel van ADAM12 als biomarker te valideren, hebben we de niveaus van ADAM12 in het serum van patiënten met alvleesklierkanker gemeten en vonden we dat dit eiwit verhoogd was in vergelijking met gezonde vrijwilligers. We vonden geen significante associatie van ADAM12 niveaus met klinische parameters zoals leeftijd, geslacht, of het stadium van de ziekte maar ADAM12 niveaus voorspelden wél slechte klinische uitkomst in deze patiëntengroep.

Samenvattend biedt dit proefschrift nieuwe inzichten in de verschillende aspecten van het stroma van alvleesklierkanker en fundamentele kennis omtrent Hh signalering; hoe de migratoire respons die resulteert in de aantrekking van fibroblasten wordt gemedieerd, hoe de ADAM eiwitten de verspreiding van Hh ligand van alvleesklierkanker cellen mogelijk maken, welke genen worden geactiveerd in reactie op Hh in het stroma van alvleesklierkanker en hoe ADAM12 niveaus in het bloed mogelijk gebruikt kunnen worden als stromale marker in patiënten. Dit proefschrift beslaat dus een breed spectrum van translationeel onderzoek, van zeer basale signaleringsmechanismen (hoofdstuk

2 en 4) tot stromale tumor biologie (hoofdstuk 4 en 5), de ontwikkeling van nieuwe

preklinische modelsystemen (hoofdstuk 3) en de mogelijke klinische toepassingen van een biomarker in het serum van patiënten met alvleesklierkanker (hoofdstuk 6). Het hier beschreven werk zal hopelijk toekomstig onderzoek helpen om meer gedetailleerd inzicht in de mechanismen van de Hh signalering, de complexe tumor - stroma interactie en de gevolgen daarvan voor tumorgroei te verkrijgen.

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deUTsCHe ZUsAMMenFAssUng

Die Kommunikation zwischen Zellen mit Hilfe extrazellulärer Signale ist essenziell für die ordnungsgemäße Organisation und Funktion multizellulärer Organismen. Diese Signale bestimmen, wohin Zellen sich bewegen müssen, in welchen Zell- oder Phänotyp sie sich entwickeln sollen, oder ob sie sich einfach vermehren, überleben oder in den programmierten Zelltod gehen. Leider sind Fehlregulationen von Signalen und Signalwegen, die diese zellulären Prozesse beeinflussen, häufig wichtige Schlüsselakteure in der Transformation von gesunden zu tumorartigen Zellen. Ein Signalweg, der während der embryonalen Entwicklung unverzichtbar ist, aber auch sehr häufig in verschiedenen bösartigen Tumoren eine bedeutende Rolle spielt, ist der Hedgehog (Hh) Signaltransduktionsweg. In Bauchspeicheldrüsenkrebs, einem schwierig zu behandelndem Tumortyp mit sehr schlechter Prognose, werden Hh-Liganden von Tumorzellen produziert und senden Signale an die umgebenden Zellen, auch Tumormikroumgebung genannt. Diese ‘normalen’ Zellen können tumorfördernde Funktionen haben und verschiedenste Medikamente gegen die Mikroumgebung von Tumoren sind derzeit in klinischer Entwicklung. Eine der bedeutendsten zellulären Komponenten der Tumormikroumgebung, auch Tumorstroma genannt, sind Fibroblasten. Diese können durch verschiedene Signale von den Tumorzellen, wie zum Beispiel Hh-Liganden, aktiviert werden und zur Aggressivität und zum Fortschritt des Tumors beitragen. Die Forschung in dieser Arbeit zielte darauf ab, neue Einblicke in die verschiedenen Ebenen der Regulation des Hh-Signalweges und der stromalen Reaktionen in Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erhalten.

Wie Zellen in unterschiedlicher Weise auf Hh-Liganden reagieren, ist nur sehr schlecht verstanden. In Kapitel 2 dieser Arbeit untersuchen wir die Relevanz des primären Ziliums für die nicht-kanonische Migrationsreaktion in Fibroblasten. Wir beschreiben, dass ziliäre Lokalisierungs-Mutanten von Smoothened (Smo) im Vergleich zum Wildtyp-Protein unterschiedliche intrazelluläre Transportwege gebrauchen und infolgedessen einen veränderten Glykosylierungsstatus aufweisen. Diese Mutanten sind darüber hinaus nicht in der Lage die transkriptionelle Reaktion zu vermitteln, zeigen jedoch verbesserte Chemotaxis zu Hh-Liganden und chemischen Smo-Agonisten. Im nächsten Schritt haben wir die chemotaktische Hh-Signalreaktion in Zellen mit defekter Zilienfunktion als Folge von genetischen Störungen in intraflagellären Transportproteinen untersucht, die für die Bildung und Aufrechterhaltung des primären Ziliums essentiell sind. Wir fanden, passend zu den bisherigen Beobachtungen mit den Smo-Mutanten, dass Zellen mit defekten Zilien erhöhte chemotaktische Reaktionen in Richtung von Smo-Agonisten zeigen, jedoch eine transkriptionelle Reaktion nicht stattfindet. Interessanterweise weisen Smo-Moleküle mit eingeschränkter ziliären Lokalisierung verbessertes Neuritenwachstum auf. Dies erweitert die Beobachtungen über Fibroblasten hinaus zu einem Entwicklungs-relevanteren Modellsystem. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Lokalisierung von Smo in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten, insbesondere dem primären Zilium, das Signalergebnis in transkriptionell (Zilien abhängig) oder chemotaktisch (Zilien unabhängig) trennen kann.

Annex

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Wie bereits erwähnt ist Bauchspeicheldrüsenkrebs eine schwierig zu behandelnde Malignität, und der Misserfolg von klinischen Studien ist teilweise auf einen Mangel an guten präklinischen Modellen zurückzuführen, welche die in Patienten gefundene Heterogenität reflektieren. In Kapitel 3 zeigen wir die Erstellung einer Gewebe-Biobank von Bauchspeicheldrüsen- und Speiseröhren-Krebspatienten, die einer chirurgische Resektion im Academic Medical Center Amsterdam (AMC) unterzogen wurden. Wir beschreiben die umfangreiche Sammlung von Gewebeproben und die Erstellung von Patienten-eigenen Xenotransplantat-Modellen sowie primären Zelllinien. Als Beispiel für Prozesse, die wir mit Hilfe des Biobank-Materials untersuchen können, vergleichen wir die Expression von Hh-Liganden in diesen Modellen und haben herausgefunden, dass die Expression von Hh zwischen Patient, Tumor-Xenotransplantat und Zelllinie konserviert bleibt, und dass weiterhin Bauchspeicheldrüsenkrebszellen effektiver Hh-Signale an stromale Zellen senden, verglichen mit Zellen von Speiseröhrenkrebs-Patienten. Diese neuen Modelle werden nicht nur bei der zukünftigen Entwicklung und Erprobung neuer Behandlungsmethoden hilfreich sein, sondern auch Unterstützung bieten, um eine bessere Einsicht in die Pathobiologie dieser Krankheiten zu gewinnen.

In Kapitel 4 erforschen wir neue Mechanismen zur Verbreitung von Hh-Liganden, die von Tumorzellen produzierten werden. Wir definieren die Rolle von ADAM Metalloproteasen in der Freisetzung von Hh von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen. Knock-down Experimente zeigen, dass die Blockierung der Freisetzung von Hh-Proteinen zu einer Akkumulation dieses Proteins an der Oberfläche von Zellen sowie einer verringerten Signalkapazität des zellulären Überstandes (Mediums) führt. Interessanterweise beobachteten wir, dass dies mit einer Erhöhung der Potenz und Signalreichweite in direkten Co-Kultur Experimenten unter Verwendung eines neu entwickelten Hh-Reportersystems einhergeht. Dies weist auf eine wichtige Rolle von zellgebundenen Hh-Molekülen in der Aktivierung des Bauchspeicheldrüsenkrebs Stromas hin.

Welche stromalen Faktoren in Reaktion auf Hh-Liganden produziert werden ist noch weitgehend unbekannt. In Kapitel 5 verwenden wir ein neues Co-Kultur-System in Kombination mit spezies-spezifischer Next-Generation-Sequenzierungs-Technik um Hh-regulierte Faktoren zu identifizieren, die in der Lage sind an Tumorzellen zurück zu signalisieren und möglicherweise eine Rolle im Krankheitsverlauf spielen. Wir haben 35 für extrazelluläre Proteine kodierende Gene gefunden, die nach Blockade des Hh-Signalweges herunterreguliert und darüber hinaus in Bauchspeicheldrüsentumorgewebe im Vergleich zu normalem Bauchspeicheldrüsengewebe überexprimiert sind. Hohe Expression von mehreren dieser Gene ist mit schlechter klinischer Prognose assoziiert, und daher sind diese Gene interessante Targets für weitere mechanistische und biologische Untersuchungen.

In Kapitel 6 fokussieren wir uns auf ein bestimmtes Gen und zeigen, dass die Metalloprotease ADAM12 in Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe überexprimiert und mit schlechter klinischer Prognose assoziiert ist. Durch molekulare Profilierung von Patienten-Xenotransplantaten (in Kapitel 3 beschrieben) fanden wir, sowohl auf transkriptioneller Ebene, als auch basierend auf Färbungen von Patienten- und Xenotransplantatgewebe, dass

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ADAM12 hauptsächlich von den Stromazellen exprimiert wird. Durchflusszytometrische

Analyse von Xenotransplantattumoren zeigte ebenfalls den stromalen Ursprung von ADAM12-exprimierenden Zellen. Bei der Durchführung von Korrelationsstudien an Genexpressionsprofilen fanden wir starke positive Korrelation von ADAM12 Expression mit Genen wie Kollagen, alpha-Smooth Muscle Actin und SPARC, welche charakteristisch für stromale Fibroblasten sind. Weiterhin fanden wir negative Korrelation von ADAM12 Expression mit dem duktalen Marker Zytokeratin 19 und dem Prozentanteil von Tumorzellen in dem jeweilige Gewebe, das für die Profilerstellung verwendet wurde. Damit einhergehend ist die Tatsache, dass in Tumoren mit hoher ADAM12 Expression Gene, die spezifisch sind für das Bauchspeicheldrüsen Stroma, sowie extrazelluläre Matrix-Gene hoch angereichert gefunden wurden. Dies deutet auf die Nützlichkeit von ADAM12 als Biomarker für den stromalen Aktivierungsstatus und generellen stromalen Inhalt von Patientengewebe hin. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass ADAM12 Expression durch das vom Tumor produzierten TGF-

β

Signalmolekül induziert werden kann. Um das Potenzial von ADAM12 als Biomarker zu erforschen, haben wir ADAM12 im Serum von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs gemessen und fanden, dass dieses Protein im Vergleich zu gesunden Probanden erhöht ist. Wir konnten keinen signifikanten Zusammenhang von ADAM12 Spiegel mit klinischen Parametern wie Alter, Geschlecht oder Stadium feststellen. Hohe ADAM12 Serumwerte prognostizierten jedoch schlechte klinische Ergebnisse in dieser Patientengruppe.

Zusammenfassend gibt diese Arbeit neue Einblicke in verschiedene Aspekte der Stroma-Biologie und des Hh-Signalweges, durch die Auseinandersetzung mit Fragen, wie die Migrationsreaktion in Fibroblasten zu Hh vermittelt wird, wie Metalloproteasen Hh-Freisetzung von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zellen beeinflussen, welche Gene nach Reaktion auf Hh-Liganden im Bauchspeicheldrüsenkrebs Stroma aktiviert werden und die mögliche Verwendung von ADAM12 als ein stromaler Serum-Marker in Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs. Diese Arbeit umfasst somit ein breites Spektrum an translationaler Forschung von wirklich grundlegenden Signalmechanismen (Kapitel 2 und 4) und stromaler Tumor-Biologie (Kapitel

4 und 5), bis hin zur der Entwicklung von neuen präklinischen Modellsystemen (Kapitel 3)

und möglichen klinischen Anwendungen eines stromalen Serum-Biomarkers in Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs (Kapitel 6). Die hier präsentierte Arbeit wird bei zukünftigen Forschungsanstrengungen hilfreich sein, um detailliertere Einblicke in Mechanismen des Hh-Signalweges zu erhalten, sowie das komplexe Tumor-Stroma-Netzwerk und dessen Auswirkungen auf die Tumorbiologie besser zu verstehen.

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ACKnOwLedgeMenTs

At the end of this long and often adventurous journey I want to thank all the people that have helped me achieve this academic milestone. In your own (special and unique) way, you made this work possible and my time spent here in Amsterdam extraordinary and unforgettable. First and foremost, Jan Paul and Maarten, thanks for picking me out from a crowd of eager PhD candidates and giving me the opportunity to work with you the last few years. For me, there couldn’t have been a better fit. Jan Paul, thank you for not letting me get lost in the tiniest details and encouraging me to focus on the positive aspects of my experiments. Maarten, you provided most of the groundwork and ideas (and not to forget the money) for my PhD position which ultimately resulted in the completion of this thesis. Words can probably not express how grateful I am for our shared experience, which was probably also quite a ride for you, so I will not even try. Only know that I am honored to have been your first…PhD student (or ‘Minion’) and I hope there will be a lot more of us for you in the coming years. Hanneke, although you were not my official supervisor on paper, I consider you as my third guide on this journey to obtain my doctorate degree, as you clearly helped to shape and refine a large part of my research since you joined the LEXOR group. Thank you for the clinical point of view you provided and your help to keep me on track with my projects. I would also like to thank the committee members for agreeing to evaluate this thesis, as well as attend and challenge me during the defense. The critical discussions will aid me in further refining my science and future research ideas.

Furthermore I want to thank the people who were instrumental in the initiation and maintenance of the Pancreas Biobank (BioPAN) project that made the establishment of the PDX models and big parts of this thesis possible, including all the surgeons, physicians and nurses. Lieke, you are the godmother of this project and without your efforts and dedication all of this would not have been achievable. Dear Shanna, I think we made a great team and I thank you for doing such a marvelous job with the inclusion of patients and chasing the resected pancreas specimen through the entire AMC. Frederike, thanks for managing to integrate the pathology department in the process. I really enjoyed our more informal meetings with the BioPAN core group and am looking forward to the upcoming one. During my PhD years the LEXOR lab has become my own quirky Amsterdam family, and I am grateful to all the members (past and present) for welcoming me with open arms and making me feel like I belong.

To my fellow Minion Veronique; you really helped me out a lot with finishing a substantial part of this thesis and I guess you will also inherit a lot of my ‘left-overs’ (sorry for that). I hope you can make something fantastic out of it, which will support you in compiling your own piece of work (aka thesis) in the not so far away future. It was really a pleasure to work together with you the last two years, so I could have somebody to share the joys and occasional frustrations that come along with exploring the ins and outs of Hedgehog signaling.

Annex

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Dear, Tommy Tom Tom, my friendly ‘little’ helper. Although you left us way before your time (ok, this sounds a little bit macabre), you were of invaluable assistance with all the biobanking of patient material and mouse work. Without you, this thesis would have probably taken substantially longer to complete. Thanks also for your dedication to work over-time when necessary and I wish you all the best at your new work place.

Eva, thanks for always having a smile on your face when seeing me in the morning (for which I still haven’t figured out completely the reason, but it also made me smile) and for your characteristic laugh (which again makes me smile), so you obviously helped maintaining a happy atmosphere for me and in the lab.

Dear Selly (the ‘rap-artist’ formerly known as Selcuk), thanks for being flexible with your experiments and often cancelling your Canto and MLII slots. With this, you frequently helped me avoid having to work at indecent (nightly) hours. And thanks for inviting us to your Big Fat Turkish Wedding; I will never forget your unwavering dance performance. Simone, Simone…although your time as a LEXORian was limited, you left a deep impression with all of us and your hour long telephone conversations in the hallway as well as the Doritos & Cola evenings and constant change in skin colour after your ‘work’ trips to Italy, will remain legendary.

Lisette, thanks for sharing your great cooking/pie making skills and your love for movies with me. I am sure you will manage to have your very own defense soon.

Valeria, dear Vale, my go-to person for anything related to SPSS and statistics. Thanks for often helping me out and also going crazy with me on the dance floor.

Dear Felipe (Fifi), it was really a pleasure to sit next to you in the office, which often led to arguments about if the heater should be turned up (obviously my choice) or rather turned off (you sitting there in your polo shirt – trying to make your point), but also resulted in very stimulating scientific discussions. Thanks for your critical thoughts and input over the years (and I assure you Hedgehog does exist).

Bregje, thanks for sharing my passion for earrings and fantasy books. Arlene, I really appreciate our casual group dinners and I admire your determination and willpower. Anne, you are one of a kind and I highly enjoyed your occasional inappropriate language and jokes. Dear Joyce, I greatly value your opinion and scientific advice and thanks for making my neck hurt when I was talking to you. Janneke, it was fun sitting next to you in the ‘new’ office and thanks for being available for a chat when I needed some distraction. Kate, thank you for your excellent sorting skills and keeping me entertained during your bantering/insulting matches with Maarten in the lab. This always kept me amused even if my experiments did not turn out as I would have hoped.

An enormous thank you I have to extend to our ‘mouse whisperer’ Hans, who not only helped start several of our animal experiments but also always kept excellent care of the

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mice, which is a very time consuming job. To all the other techs, Saskia, Joan, Ronald and

Kieshen; thanks for keeping the lab up and running and everything in order.

Thanks to all the other LEXOR people (Louis, Klaas, Raju, Kristiaan, Sander, Remy, Stephanie and Maartje) for being part of my (PhD) life for the past years and always willing to answer my (frequent) questions and provide a helping hand. Also a big thanks goes to all the past lab members (Tijana, Kristel, Catarina, Melania, Suzanne, Michael, Marco and Fiona) for easily accepting the young and naive me in your midst.

Kun, I thank you for doing this amazing road trip through California with me and sharing your expertise, cells, inhibitors and what not. I was always really glad to have a fellow pancreatic cancer researcher to exchange ideas and views with.

I am furthermore really grateful to my Italian flat mate and friend Rossella. Thank you for teaching me the value of freshly grated parmesan on my pasta and possessing the same degree of laziness when it comes to cleaning or doing the dishes. I couldn’t have found a better suited person to share a flat with for the past three years and I am grateful we met on that fateful day at that bus stop on our way to the AMC.

And of course to my fellow ‘kitties’ Dita, Cheryl and Evelyn (and I can’t believe this name really did stick in the end; not sure if I should thank or curse you for this Dita!). You all made me feel accepted, welcome and comfortable (inside and outside of work) right from the moment I arrived here in Amsterdam. Without you guys I probably wouldn’t have had such an easy time integrating into the lab and living in the Netherlands. I highly value our shared PhD experience and friendship. I hope that in years to come we will stay in contact and still be able to occasionally meet up for coffee (with cookies of course) or another round of High Tea. The biggest thank you still goes to my family, who always under any circumstances supported me and my decisions, even if these resulted in me living hundreds of kilometers away from home. Liebe Goli, du warst immer ein gro

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es Vorbild für mich, als eine unabhängige und starke Frau. Du hast dich immer dafür eingesetzt, dass wir etwas au

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erhalb unseres Heimatortes und -landes kennen lernen. Dies hat mir geholfen, diesen bedeutenden Schritt zu machen und Mut zu finden um meine Doktorarbeit im Ausland durchzuführen. Das grö

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te Dankeschön geht natürlich an meine Eltern. Lieber Papa, liebe Mama; danke für eure unermüdlichen Ünterstützung in allen Lebenlagen und euren Glauben und euer Vertrauen an mich, dass ich alles nur Mögliche auch erreichen kann.

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CUrriCULUM ViTAe

The author of this thesis was born on February 5th _{1986 in Steyr, Austria to parents living}

in a quaint little village called Kroisbach. Her school education was directed towards music, creativity and art, but after finishing high school with a ‘Matura’ and a degree for kindergarten pedagogics in 2005, she decided her real calling to be the world of science and started to study biology at the University of Salzburg. After receiving her Bachelor’s degree in Genetics in 2008, she continued with a Master’s Program in the same discipline, which she successfully completed in 2010. During her master thesis under the supervision of Dr. Fritz Aberger, she already gained interest in the workings of the Hedgehog signaling pathway especially in the context of different malignancies. This topic she could continue to pursue, right after the completion of her Master’s degree, in the LEXOR laboratory of Professor Jan Paul Medema at the Academic Medical Center in Amsterdam under co-supervision of Dr. Maarten Bijlsma, where she focused her PhD research on Hedgehog signaling in pancreatic cancer, which is described in this thesis.

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pOrTFOLiO prOeFsCHriFT

phd period: November 2010 – April 2015

name phd supervisor: prof. dr. Jan Paul Medema

name phd co-supervisor: dr. Maarten F. Bijlsma

pHd TrAining Year eCTs

Courses:

Laboratory Animal Science, article 9 (Utrecht) 2010 3

Anatomy of the house mouse (OOA coarse) 2011 1.1

Practical biostatistics 2012 1.1

Cancer Genome Analysis (OOA course) 2012 2

Medline/Embase/Endnote course 2014 0.2

Advanced qPCR course (AMC graduate school) 2014 0.5

seminars and workshops:

Department Seminars (CEMM) 2010-2015 5

AMC Oncology Semiars (OASIS) 2010-2015 10

Symposium Preclinical Assays in Cancer Therapy 2012 1.1 Workshop R2: Analysis of Tumor Genomics Data 2013 0.1 CGC meeting (Tropenmuseum, Amsterdam) 2013-2014 2.2

presentations and conferences:

Annual OOA PhD retreat (Texel, NL, poster) 2011 1

Annual OOA PhD retreat (Ermelo, NL, oral) 2012 1

Hh conference (Kalumbariy, GR) 2011 1

AACR Pancreatic cancer conference (Lake Tahoe, NV, USA, poster) 2012 1

HH conference (Arolla, CH, poster) 2013 1

HH conference (Ann Arbour, MI, USA, poster) 2014 1 AMC oncology seminars (OASIS, Amsterdam, oral) 2013 1

supervision:

ERASMUS Masterinternship (University of Barcelona) 2011 1.5 Masterstudent (University of Montpellier) 2012 1.5 Literature Internship, Masterstudent (UvA) 2014 1

Awards:

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LisT OF pUBLiCATiOns

Eberl M, Klingler S, Mangelberger D, Loipetzberger A, damhofer H, Zoidl K, Schnidar H, Hache H, Bauer HC, Solca F, et al: Hedgehog-EGFR cooperation response genes determine the oncogenic phenotype of basal cell carcinoma and tumour-initiating pancreatic cancer cells. EMBO Mol Med 2012, 4:218-233.

Bijlsma MF, damhofer H, Roelink H: Hedgehog-stimulated chemotaxis is mediated by smoothened located outside the primary cilium. Sci Signal 2012, 5:ra60.

damhofer H, Medema JP, Veenstra VL, Badea L, Popescu I, Roelink H, Bijlsma MF:

Assessment of the stromal contribution to Sonic Hedgehog-dependent pancreatic adenocarcinoma. Mol Oncol 2013, 7:1031-1042.

damhofer H, Veenstra VL, Tol JA, van Laarhoven HW, Medema JP, Bijlsma MF: Blocking

Hedgehog release from pancreatic cancer cells increases paracrine signaling potency. J Cell Sci 2015, 128:129-139.

damhofer H, Ebbing EA, Steins A, Welling L, Tol JA, Krishnadath KK, van Leusden T, van de

Vijver MJ, Besselink MG, Busch OR, et al: Establishment of patient-derived xenograft models and cell lines for malignancies of the upper gastrointestinal tract. manuscript under revision

damhofer H, van Rijssen LB, Veenstra VL, van de Vijver MJ, Dijk F, Wilmink JW, Besselink MG,

van Leusden T, Medema JP, van Laarhoven HW, Bijlsma MF: ADAM12 is a serum biomarker for stromal activation and prognosis in pancreatic cancer patients. manuscript in preparation Shi K, damhofer H, Daalhuisen JB, ten Brink MS, Richel DJ, Spek CA: Dabigatran potentiates gemcitabine-induced pancreatic cancer regression in mice. manuscript submitted