Het aantonen van bebroede eieren in eiprodukten aan de hand van het 3-hydroxyboterzuurgehalte

Afdeling Eiwitchemie 1984-09-20 RAPPORT 84.72* Pr.nrs. 404.9101/505.9020 Onderwerp: Het aantonen van bebroede eieren in eiprodukten aan de hand van het 3-hydroxyboterzuurgehalte.

COVP ir Th.G. Uijttenboogaart ir A.T.G. Steverink RIKILT: drs H.L. Elenbaas H. Haasnoot drs B.G. Nuuse Projektnunm1er 683 (COVP) 404.9101/505.9020 (RIKILT)

Projektleiders: ir A.T.G. Steverink (COVP) drs H.L. Elenbaas

Overige medew.:

c.

van Cruijningen (COVP) D. Dijk (COVP)

H. Haasnoot (RIKILT) B. Rutjes (RIKILT) P. Stouten (RIKILT)

Verzendlijst: direkteur, sektorhoofden, direktie VKA, afd. Eiwitchemie (4x), afd. Normalisatie/Harmonisatie (Humme), Projekt-beheer, Projektleider (Elenbaas/Haasnoot), VD (2x), RVV (2x), Den Hartog, AID, Serlabo (drs Olsman).

*

Dit verslag verschijnt ook als COVP-Hededeling No. 413. 8472

Samenvatting

De ontwikkeling van een enzymatische en een gaschromatografische methode voor het aantonen van 3-hydroxyboterzuur is in het kort beschreven. Een meer uitgebreide beschrijving plus toetsing en vergelijking van beide methoden is ,, elders gegeven (IS). Beide methoden zijn gelijkwaardig gebleken.

Met behulp van de enzymatische methode is het 3-HBZ gehalte bepaald in con-sumptie-eieren (batterij en scharrel) onbebroed en bebroed, broedeieren

(heldere en op verschillende tijdstippen spontaan en geforceerd afgestorven), eiprodukten (vóór en na pasteuriseren en met en zonder toevoegingen), koel-huiseieren en micro-bio_logisch bedorven eieren. Hierbij is gebleken, dat het 3-HBZ gehalte in eieren, welke langer dan 6 dagen zijn bebroed, ook na :zeer zorgvuldig schouwen, zeer hoog is vergeleken met consumptie~eieren (ca. 30 tegen ca. 0.7 mg/kg). Het gewogen gemiddelde zowel voor 6-dagen bebroede heldere ~ieren als voor heldere plus twijfelachtige is 1.0 mg/kg.

Ter verklaring van diverse resultaten is een proef uitgevoerd om het effect van het tijdstip van afsterven van de kiem op het gehalte aan 3-HBZ te meten.

Summary

The development of an enzymic and a gas chromatographic method for the determination of 3-hydroxybutyric acid (3-HBA), to indicate whethèr or not incubator reject eggs have been incubated for Jonger than 6 days, is described in brief. A more detai led description and the comparison of both methods as well as the results summarized in this report wi ll be published elsewhere (15, 17). lncubated and not incubated consumption eggs (battery cages and deep litter), cold stored eggs, hatchery eggs (clears, forced and spontaneously died), egg products before and after pasteurization withand , without additions and bacteriologically spoi led eggs have been analysed with

the enzymic method to get an overall idea of the presence/development of 3-HBA. Only for incubator rejects held in incubators for Jonger than 6 days the average amount of 3-HBA, even after being candled very care-fully, is much higher (approx. 30 mg/kg) than that in consumer eggs

(approx. 0.7 mg/kg).

Thè weighted mean for 6-days incubator clears as well as for 6-days incubator clears plus doubtfuls is 1.0 mg/kg.

In order to explain some results the effect of the moment of embryo growth terminatien on the 3-HBA content has been investigated.

2

-Aangezien de gewenste methode ook geschikt moet zijn voor eieren die bepaalde verwerkingsfasen hebben ondergaan (b.v. pasteurisatie) waar-bij eveneens denaturatie van proteïnen plaatsvindt, zijn gedenatureerde proteïnen geen geschikte indicator voor het aantonen van bebroede eieren in eiprodukten. Bovendien hebben Csuka etal. (3) aangetoond, dat het gedurende zeven dagen bebroeden van onbevruchte verse eieren tot ontleding van

proteïnenfracties leidt. Dit betekent dat methoden als electraforese (3, 4) en het meten van de toename aan reducerende proteïnen

(5)

niet bruikbaar zijn.

De vorming van 3-HBZ dóor een embryo in ontwikkeling werd voor het eerst gerapporteerd door Salwin etal . (6) en de moge! ijkheld om het 3-HBZ te gebruiken als indicator voor de aanwezigheid van bebroede eieren werd door hen aangegeven. In latere studies werd de bruikbaarheid van deze indicator bewezen (7-14).

Het gehalte aan 3-HBZ kan o.a_. worden bepaald langs gaschromatografische (6-13) en enzymatische (14) weg. De door Parry etal. beschriven enzy-matische methode (14) leek geschikt als screeningstest, zij het, dat een onderste detectiegrens van ca. 2 mg/kg hoog is, zeker als men bedenkt,

dat in de Engelse 1 iteratuur (10) 2 mg 3-HBZ/kg heelei wordt voorgestèl.d als richtwaarde voor normering. Daarom werd in eerste instantie gewerkt aan verbetering van de enzymatische methode, teneinde een lagere detec-tiegrens te bereiken.

Gel ijktijdig werd gewerkt aan een tweede, verificatie-, m~thode. Daarbij werd uitgegaan van bestaande gaschromatografische procedures (10, 13). Vanwege het tijdrovende karakter van deze methoden (ca. 6t uur) werd ge-zocht naar modificaties van de verschi !lende bewerkingsfasen, waarbij tijdsbesparing niet ten koste van de nauwkeurigheid mocht gaan.

Beide methoden werden getest op eieren en eiprodukten van uiteenlopende aard, deels afkomstig uit de praktijk en deels van het Spelderholt

(zie hoofdstuk 3). ·

Alle in dit rapport weergegeven resultaten zijn verkregen met de en-~y~~!l~~b~-~~!b9~~· Resultaten van tussentijds onderzoek en over de ver-gel ijking van beide methoden zijn te vinden in een aantal RI

- 3

-2. Ontwikkeling van een enzymatische en gaschromatografische methode voor het bepalen van 3-hydroxyboterzuur.

De twee hieronder bes~hreven methoden, de enzymatische en de gaschromato-grafische methode, zijn geschikt ~oor het bepalen van lage gehalten aan 3-HBZ in monsters vloeibaar heelei en eiprodukten.

De beide methoden zijn getoetst en met elkaar vergeleken bij lage con-centraties 3-HBZ, tot 5 mg/kg.

Uit een statistische evaluatie is gebleken, dat beide methoden gelijk-waardig zijn (15). Het terugvindingspercentage en de standaardafwijking zijn in het getoetste gebied ca. 95%, respectieve! ijk 0.33 mg/kg.

Met beide methoden kunnen 15 tot 20 monsters per dag worden onderzocht.

Het 3-HBZ wordt door middel van perchloorzuur uit het monster geëxtra-heerd. In de oplossing wordt.het perchloorzuur verwijderd door het neer te slaan met kaliumhydroxide. Het 3-HBZ in de perchloorzuur-vrije oplos-sing wordt met behulp van het enzym D-3-hydroxyboterzuurdehydrogenase

(3-HBZDH) en het co-enzym NAD~ geoxideerd tot acetoazijnzuur, volgens de vergel ijking:

CH

₃

CH(OH)~H

₂

COOH + NAD+ ~ CH

3COCH2COOH + NADH

Om de reactie vol ledig te late~ ver)op~n wordt hy?razJnehydra~t toege-voegd. De totale hoeveelheid NADH wordt fotometrisch gemeten bij een golflengte van 340 nm. Het gehalte 3-HBZ wordt berekend aan de hand van de hoeveelheid NADH met behulp van de mol~ire absorptiecoëfficiënt van NADH.

De methode is gebaseerd op een door Parry etal. (14) beschreven enzy-matische methode. De detectiegrens van die methode is ca. 2 mg 3-HBZ/kg, te hoog om de lage gehalten van minder dan 1 mg/kg in niet bebroede en/ of onbevruchte eieren te meten, zoals gaschromatografisch is bepaald (10) .

-

~

-Om de detectiegrens te verlagen z~jn de volgende modificaties aan de methode van Parry aangebracht:

- De monsteroplossingen zijn meer geconcentreerd gemaakt;

- De totale hoeveelheid NADH na afloop van de enzymatische reactie wordt gemeten en niet de hoeveelheid NADH die tijdens het begin van de reactie per tijdseenheid wordt gevormd;

- Een zo zuiver mogelijk enzym 3-HBZDH met een zo hoog mogelijke acti-viteit moet worden gebruikt;

- Het fotometrisch meten van de totale hoeveelheid NADH in het monster moet gebeuren tegen _een monsteroplossing met alle reagentia, maar zonder enzym.

De eerste twee modificaties verhogen de nauwkeurigheid en gevoeligheid, maar hebben als nadeel een langere analysetijd en het optreden van storingen door verontreinigingen van het enzym met de enzymen lactaat- en malaatde-hydrogenase. Om deze storingen te onderdrukken is de derde modificatie aangebracht: gebruik van het enzym van de fa. Sjgma (cat.nr.· H 4005) in plaats vari het enzym van de fa. Boehringer. Modificatie vier is ingesteld, omdat bi ijkt dat, in tegensteil ing tot wat Parry en medewerkers beweren, de mnns;teropÎ~ssin"g bij .. de te -met~n golflengte:v..an. .. J4o.:n~:èen·.:.t)·~.P-~~de. achtergrond absorptie vertoont. Door deze modificaties kon de detectie-grens worden teruggebracht van 2 naar 0.5 mg 3-HBZ/kg.

Een heldere .waterige oplossing van 3~HBZ wordt bereid ~por een eihomo-genaat, waaraan glutaarzuur als interne standaard is toegevoegd, te klaren met zwavelzuur en fosforwolfraamzuur; Een deel van de oplossing wordt op een Extrelut kolom gebracht, die het water adsorbeert. Het 3-HBZ, glutaar-zuur en andere verbindingen worden met ethylacetaat van de kolom geëlueerd. Vervolgens wordt het eluaat na toevoeging van adipinezuur, een tweede

interne standaard ter controle van de analyse, tot droog ingedampt. De organische zuren worden onder verwarming met zoutzure methanol ge-methyleerd. Het zoutzuur wordt vervolgens met ammoniak~le methanol ge-neutra! iseerd en de oplossing wordt met natriumbicarbonaat op pH gebracht. Na ultra-filtratie is de oplossing gereed voor het gaschromatografisch onderzoek.

Figuur

- 5

-In de gaschromatograaf wordt 1 ~1 geïnjecteerd en 1:7 gesp! it. De com-ponenten worden op een CP Wax

57

CB fused sil ica capillaire kolom (20 m x 0.22 n{m i .d.) onder bepaalde omstandigheden gescheiden (fig. 1).

Het gehalte

3-HBZ

in het monster wordt berekend uit de piekoppervlakten van

3-HBZ

en glutaarzuur en met behulp van de responseverhouding van glutaarzuur en

3-HBZ

in de vlamionisatiedetector.

De methode is een verbeterde versie van diegepubliceerd door Littmann

~· (13). Met name de tijdsduur van de analyse· is teruggebracht van ca. 6~ tot ca. 2~ uur.

Een praktisch gebrek van de methode is het dichtslibben van de kolom met zout, waardoor al na 20-100 injecties effecten in het chromatogram zicht-baar worden. Dit probleem kan worden ondervangen door te silyleren in plaats van

t~

methy)eren. Silyleren geeft ookdemogelijkheid om

split-less (on-column) te injecteren waardoor de detectiegrens van de methode tot onder 0.1 mg/kg.kan worden.verlaagd.

N CD :I: I

"'"'

I... :J :J N I... co ro

...,

:J I... :J :J N (!) c:: c. -o ro

6

-3. Gehalten 3-HBZ in consumptie-eieren, koelhuiseieren, bevruchte niet bebroede eieren, eiprodukten en bedorven eieren

Voor een goed begrip van hetgeen in dit :hoofdstuk zal worden besproken, is het noodzakelijk vooraf enige toefichting te geven.

Tijdens de ontwikkelingsfase van de (enzymatische) methode zijn vele monsters eieren onderzocht. Op een bepaald moment werden gehalten 3-HBZ gevonden tussen

1 en 2 mg/kg voor consumptie-eieren, bevruchte niet bebroede eieren, koelhuis-eieren en verschi 1 lende eiprodukten.

Op basis van 1 iteratuurgegevens was echter bekend, dat, met name consumptie~

eieren, lagere gehalten 3-HBZ bevatten (10). Daarom werd, met succes, ge-tracht de methode zodanig te verbeteren, dat deze lagere gehalten ook bereik-baar waren. Vervolgens is een gedeelte van de hiervoor genoemde type eieren opnieuw onderzocht hetgeen gemiddelde gehalten variërend van 0.7 tot 1.1 mg 3-HBZ/kg opleverde. Deze resultaten zijn samengevat in tabel 1. De monsters waarvan om verschi !lende redenen geen nieuwe analyses konden worden uitge-voerd zullen wel worden besproken, maar zijn niet in de tabel opgenomen.

Dit om te voorkomen, dat bij het beschouwen van de tabel alléén, verkeerde conclusies worden getrokken.

Uit de 1 iteratuur is bekend dat niet alleen in bebroede eieren, maar in alle eieren 3-HBZ voorkomt. Wi 1 3-HBZ een goede indicatie zijn om bebroede eieren in eiprodukten aan te tonen, dan ~s het van belang de gehalten in al Ie moge-lijke eieren en eiprodukten te kennen. Tevens dient bekend te zijn wat de

invloed is op het 3-HBZ gehalte van bepaalde handelingen zoals opslag bij

verschi !lende temperaturen en verwerkingsmethoden.

Het gehalte 3-HBZ in consumptie-eieren is in dit onderzoek beschouwd als basis. Zowel voor batterij- als voor scharreleieren werd een gemiddelde

3-HBZ gehalte gevonden van 0.7 mg/kg (tabel 1), hetgeen in goede overeenstemming

·is met in de I iteratuur vermelde gaschromatografisch verkregen resultaten (JO). De spreiding in het gehalte 3-HBZ in consumptie-eieren afkomstig van

ver-schillende koppels is gel ijk aan die na herhaalde analyse van één monster met een gehalte van 0.8 mg/kg. Hieruit volgt dat de spreiding in het gehalte in consumptie-eieren kleiner is dan de spreiding in de analyse.

De gehalten 3-HBZ in bevruchte en vervolgens bewaarde eieren zijn van dezelfde grvotte orde als die in consumptie-eieren (tabel 1). Deze conclusie stemt overeen met die van Thomas en Stock (12) voor eieren bewaard bij 20-25°c. Bewaren van bevruchte eieren bij 30°c leidde volgens dezelfde onderzoekers reeds na JO dagen tot een vertienvoudiging van het 3-HBZ gehalte.

-

7

-Tabel 1 3-HBZ gehalte (in mg/kg vloeibaar heelei) in oonswnptie-eieren) bevruchte niet bebroede eieren) eipr>odukten en bedor>Ven eieren.

Consumptie-eieren : batterij

scharrel

Bevruchte niet bebóoede eieren

bewaard bij 20-25 C : 6 dagen 12 dagen 18 dagen Eiprodukten : heeleipoeder met broedeill! vloeibaar heelèi Bedorven eieren lt

met 5-100% toegevoegd broedei

n 15 5 3 _.. 3 3 3 5 15 6 x 0.7 0.7 1.0 1.0 0.8 1.1 0.7 29.6 1.5 min.-max. 0.4 - 1.0 0.4 - 1.0 0.5 - 0.8 6.0 -120.3 0.6 - 2.8

Koelhuiseieren, om in de inleiding van dit hoofdstuk genoemde redenen niet

opge-nomen in de tabel, vertoonden eveneens een gehalte 3-HBZ vergelijkbaar met dat

van consumptie-eieren.

Eiprodukten: Wil een methode voor het aantonen van bebroede eieren in

ei-produkten betrouwbaar zijn, dan mag geen enkele behandeling van de eieren

aanleiding zijn voor afwijkende analyseresultaten. Om dit te controleren

zijn monsters vloeibaar heelei en heeleipoeder onderzocht.

Van een serie van 24 monsters Yl2!!~~~r_b~!!!l• waarin volgens de fabrikanten

geen broedeieren waren verwerkt, bevatten 18 monsters 3-HBZ gehalten van

dezelfde grootte-orde als consumptie-eieren. De overige 6 monsters vertoonden

gehalten 3-HBZ tot ca. 7.5 mg/kg. Op grond van de resultaten van het hier

beschreven onderzoek 1 ijkt het aannemelijk dat in de genoemde 6 monsters

geringe hoeveelheden uitgeschouwde broedeieren zijn verwerkt. Ook de resultaten

van deze monsters zijn om eerdergenoemde redenen niet opgenomen in tabel 1.

De Y!2!!~~êr_b!!!!! monsters waarin verschillende hoeveelheden (5-100%) uitgeschouwde heldere broedeieren waren verwerkt vertoonden eenduidelijk

verhoogd 3-HBZ gehalte.

;.

- 8

-Ofschoon slechts een klein aantal_ ~~e~!!!~r!!~~r~~ monsters beschikbaar was, mag, mede gezien de resultaten van Jones en Eli i_ngworth (11), worden ~~con~­

cludeerd, dat deze behandeling geen invloed heeft op het 3~HBZ gehalte.

Ter completering van het onderzoek naar het aantonen van bebroede eieren in eiprodukten via het gehalte aan 3-HBZ kwam de vraag aan de orde in .welke mate het bedorven ztjn van eieren ook een verhoogd gehalte kan geven. ·

Om deze vraag te beantwoorden is een aantal bedorven eieren bemonsterd. Hierbij werden consumptie-eieren gebruikt die spontaan en na inoculatie met

Bacillus cereus en incubatie bij 30°c zijn bedorven. Het maximum gehalte 3-HBZ

dat werd aangetroffen bedroeg 2.8 mg/kg (zie tabel I), dat wi 1 zeggen

significant hoger dan in consumptie-eieren. Toch zal dit geen probleem

op-leveren voor het stellen van normen voor het 3-HBZ gehalte, daar bedorven

eieren (ook} niet mogen worden verwerkt.

4.

Gehalten 3-HBZ in uitgeschouwde broedeieren

Het onderzoek richtte zich vervolgens· op de geh"alten 3-HBl in op vers- chil-lende ttjdstippen uitgeschouwde broedeieren, Daartoe zijn bij een aantal broederijen uitgeschouwde heldere broedeieren gehaald. Afhankelijk van de

broe~erij werd meestal geschouwd tussen de lOe en_ 18e broeddag. Sij_ enkele

broederijen werden monsters verk~egen van

7

dagen bebroede heldere eieren.

Elk monster bestond steeds uit 60 eieren. Deze werden op bet Spelderholt

nageschouwd en verdeeld in heldere, twijfelachtige en niet heldere eieren, om de wijze van schouwen op het 3-HBZ gehalte te beoordelen.

De categorie niet heldere eieren bestaat uit eieren die ten onrechte in het monster aanwezig zijn (schouwfouten). Over de definitie van de cate-.

gorie twijfelachtig kan men van mèning versebi llen. Per monster is de helft van elke categorie apart uitgeslagen en, voor zover mogelijk, tot een drietal mengmonsters (helder, twijfelachtig, niet helder)_ verwerkt. De andere helften van de drie categorieën werden samengevoegd tot een totaal gemiddeld monster van de hele parttj. De resultaten staan vermeld ·

in tabel 2. Opvallend ts de grote variatie in de 3-HBZ gebalten van de

mo.[1sters, hetgeen moge blijken uit figuur 2. Tevens blijkt dat goed

v E 2

-w

-- 9

-Voor de eieren geschouwd tussen de 7e en 18e dag blij ft het gehalte 3-HBZ

in de categorie helder met 29 mg/kg hoog. Verder valt op dat bij de

twij-felachtige eieren uit de praktijk een hoger gehalte 3-HBZ wordt aangetroffen

dan bij de niet heldere. Op demogelijke oorzaken van dit verschijnsel wordt

in hoofdstuk 5 nader ingegaan.

Tabel 2 3-HBZ gehalten ~n tussen de ?een 18e dag-uitgeschouwde eieren

-z-n mg/kg n x min.-max. Praktijk (gemiddeld) 30 76 1.5-338 Op COVP nageschouwd helder 30 29 0.7-143 twijfelachtig 28 242 10 -424

niet helder (afgestorven) 7 98 46 -214

...

-r--r- r - r - r - r--I I I I r--I 0 50 100 150 200 250 300 350 3-HBZ gehalte (mg/kg)

Figuur 2 Frequentieveraeling van het 3-HBZ gehalte in praktijkmonsters uitgeschouwd:

- 10

-Omdat er in de praktijk weinig 6-daagse uitgeschouwde heldere eieren

beschik-baar waren, zijn op het Spelderholt 19 groepen van elk 120 eieren, afkomstig uit de praktijk, ingelegd en na 6 dagen geschouwd. Ook hierbij is per groep eieren, voor zover mogelijk, eenonderverdeling gemaakt in heldere, twijfel-achtige en 11_afgestorven11 _{eieren. De resultaten van de analyses van· deze}

eieren staan in Tabel 3.

Tabel 3 3-HBZ gehalten in op de 6e dag uitgeschouwde eieren~ in mg/kg

1 x(gew. )3 min.-max. n x Helder (H) 19 253 1. 0 1.0 0.4 1. 8 Twijfelachtig (T) 7 10 1. 4 l. 4 0.7 2.4 H + T 26 263 l. 1 l. 0 0.4 - 2.4 Afgestorven 18 53 10.2 9.7 2.9 -41.4

!)aantal monsters, 2) aantal eieren, 3) gewogen gemiddelde

De gedurende 6 dagen bebroede heldere eieren vertoonden na analyse een 3-HBZ gehalte van gemiddeld 1.0 mg/kg (gewogen gemiddelde eveneens 1.0 mg/kg.

De eieren van de categorie 11_{twijfelachtig}11 _{zul Jen in de praktijk, ten minste}

voor een deel, bij de heldere terecht komen. Daarom is het zinvol de catego-rieën helder en twijfelachtig als één groep te beschouwen.

Voor de in de tabel opgenomen resultaten heeft dit slechts tot gevolg dat alleen het rekenkundige gemiddelde enigszins wordt verhoogd (gaat van 1.0 naar I. 1. mg/kg). Voor het gewogen gemiddelde maakt het niet uit dat de

resultaten van H.en T worden samengevoegd. Binnen de categorie

twijfel-.achtig werd voor één monster (bestaande uit één ei) een 3-HBZ gehalte ge-vonden van 19.1 mg/kg. Een duplo-bepaling van dit monster was niet

moge-lijk, omdat er onvoldoende materiaal over was. Daarom kon niet worden na-gegaan of deze uitbijter, volgens welke toets dan ook, het gevolg was van een vergissing tijdens het schouwen of een analysefout.

Daar bij controle in de praktijk nooit een enkel ei zal worden geanaly-seerd, maar een mengmonster van een ••goede steekproef11

, zal een enkele

v~rgissing bij het schouwen geen probleem opleveren zoalsblijkt uit het

gewogen gemiddelde, dat op 1.1 mg/kg komt indien de waarde 19.1 mg/kg wordt

o I

11

-Een exacte berekening van de spreiding over verschil lende monsters is niet moge I ijk, vanwege de ongelijke verdeling van de eieren in de monsters.

De gemiddelde analysespreiding van de methode zelf over het traject van 0- 5 mg/kg is 0.33 mg/kg (15).

Op grond van de in dit onderzoek gebruikte eieren levert een schatting van de standaardafwijking een waarde op van 0.36 mg/kg voor heldere 6-daagse eieren. Tabel

4

geeft een overzicht van de geschatte (gewogen)

standaardafwijkingen en enige éénzijdige overschrijdingswaarden.

Tabel

4

Gewogen gemiddelden~ standaaPdafwijkingen en de

oversahPijdings-waarden met bepaalde betPouwbaaPheid (eenzijdig) in mg 3-HBZ/kg

van de in tabel 3 genoemde heldePe en twijfelachtige eieren

Helder H + T x(gew.) 1 . 0 1. 0 s (gew.) 0.36 0.37 overschreidingswaarden

5

%

1%

1.6 1 .6

1.9

1.9

5. Effect van het tijdstip van afsterven van de kiem op het 3-HBZ gehalte Voor het verkrijgen van enig inzicht in het verloop van het gehalte

3-HBZ in eieren tijdens het broedproces en voor het vinden van een verklaring

voor het hoge gehalte 3-HBZ in de ''twijfelachtige" eieren van de praktijk-monsters, is een experiment uitgevoerd waarbij de kiemen kunstmatig werden

gedood en de eieren vervolgens verder werden bebroed. Van de levende

kiemen werd het 3-HBZ gehalte in een mengmonster van 15 eieren vastgesteld op de broeddagen 1, 4, 7, 10 en 13. Op ·elk van deze dagen werd een aantal eieren afgekoeld tot 0°C,gedurende enkele uren bij deze temperatuur

opge-slagen en vervolgens teruggeplaatst in de broedmachine. De eieren be-handeld op dag 1 werden bemonsterd op de dagen 4,

7,

10, 13 en 18; de eieren behandeld op dag 4 werden bemonsterd op de dagen 7, 10, 13 en 18; etc. Telkens werd een mengmonster van ca. 15 eieren van elke categorie samengesteld. De resultaten van deze proef staan weergegeven in figuur 3. De koude behandeling op dag 1 had een niet voldoende kiemdodend effect. Slechts enkele eieren vertoonden bij voortgezet broedproces geen groei.

- 12

-Deze eieren kunnen een afgestorven kiem bevatten, maar het is ookmogelijk dat het onbevruchte eieren zijn geweest of eieren waarvan de kiem reeds was afgestorven. Eieren waarvan·de kiem op dag 4 werd gedood vertoonden een exponentiële toename yan 3-HBZ, aanvankei ijk zelfs groter dan bij "levende" eieren. Behandeling op dag

7

gaf nog slechts een geringe stij

-ging in 3-HBZ gehalte en de op de dagen 10 en 13 behandelde eieren laten een daling in 3-HBZ gehalte zien bij voortgezet broedproces.

Gedeelte! ijke herhaling van het experiment, waarbij de eieren werden be-handeld op dag 3, 4,

5

en 6 bevestigden het beeld verkregen in het eerste experiment, nl. dat de stijging in 3-HBZ gehalten bij het afsterven van de kiem op dag 4 het grootst is. Dit verschijnsel, ook waargenomen door Salwin etal. (6), verklaart het hoge gehalte 3-HBZ in lang bebroede eieren van de categorie "twijfelachtig~' in vergelijking met de niet heldere

(zie hoofdstuk 4). De laatste categorie bevat vermoedel ijk een groot per-centage eieren dat later in het broedproces is afgestorven,· en vertoont daardoor lagere 3-HBZ gehalten.

Het significante versch i 1 (Wi 1 coxon- toets) in 3-HBZ geha 1 te tussen de 6-daagse heldere eieren en de consumptie-eieren (1 .0 vs. 0.7 mg/kg) wordt veroorzaakt doordat er tussen de heldere eieren zich exemplaren bevinden, waarvan de kiem vóór de 4e dag is afgestorven en 3-HBZ is gaan produceren.

Q) ..., co .r:. Q) en N co :r: I M 600 (ai/k.') 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 - 13 -I I I I I I I

I

I / . I I I I

,'1\ /

I , . i

i\ ... -

·

--....

s

. i/'\, I . . ; .1/ '· • 11 ' .' /i '· . I ·I '· . !Î ',,~ I '/ I}

l

/ -

,.

.

""'-

·-

·

-/ ;

·,,

/, , / \

I

,,...

\ I . 'I/"'·, •

.t

/

'"'-·-·-

·-·

-·-.

/ ; ', .

--

. ....

~.// ~

~

~ ~.~·-.-

.

::.

8' 12 16 broedtijd (dagen)>

Figuur 3 Invloed van het tijdstip van afsterven op het verloop van

het 3-HBZ gehalte. De cijfers bij de curven geven de dag van

de koude behandeling aan.

-

...

-

-

- -

.

3-HBZ gehalte na koude behandeling

14

-6. Conc 1 us i es

- Zowel de enzymatische als de gaschromatografische methode is geschikt gebleken voor het bepalen van 3-HBZ. De onderste detectiegrens van de enzymatische methode is ca. 0.5 mg/kg, die van de gaschromatografische

is lager dan 0.1 mg/kg.

- Er is geen onderscheid aantoonbaar In het 3-HBZ gehalte van consumptie-eieren van verschillende koppels. De totale spreiding in het 3-HBZ ge-halte voor monsters van verschi !lende koppels ligt in dezelfde gr.ootte-orde als die van de analyse.

- Het is niet moge! ijk op grond van uitwendig schouwen onderscheid te maken, zoals de wet vereist, tussen bevruchte en onbevruchte heldere eieren.

- Het 3-HBZ gehalte in eieren welke gedurende langer dan 6 dagen zijn be-broed, is, ook na zeer zorgvuldig schouwen, erg hoog vergeleken bij

consumptie-eieren (ca. 30 tegen ca. 0,7 mg/kg).

De 6 dagen bebroede eieren in dit onderzoek bevatten, na verwijdering van de monsters met zichtbare afgestorven kiemen, een gewogen gemiddeld

gehalte van 1.0 mg/kg 3-HBZ met een grenswaarde van 1.6 (p_-;0.05) en

1 • 9 ~ p<O . 0 1 ) •

- Het hoge gehalte 3-HBZ in langer dan 6 dagen bebroede eieren van de

categorie "twijfelachtig", kan worden verklaard-uit het moment van

af-sterven van de kiem. De hoogste gehalten worden gevonden in eieren,

waarvan de kiem op de vierde broeddag is afgestorven. Omdat het niet mogelijk is door middel van schouwen onderscheid te maken tussen langer

dan 6 dagen bebroede)heldere,vroegtijdig afgestorven eieren en

onbe-vruchte eieren, kunnen zeer hoge gehalten 3-HBZ voorkomen in met dergelijke

te lang bebroede eieren bereide eiprodukten.

- Indien in monsters een lager gehalte 3-HBZ wordt gevonden dan 2-3 mg/kg

is dat géén garantie dat de eieren niet langer dan 6 dagen zijn bebroed.

Indien het gehalte hoger 1 igt dan 2-3 mg/kg dan zijn er of niet heldere

6-daagse bebroede-eieren of langer dan 6 dagen bebroede eieren verwerkt_.

-Het opslaan van bevruchte eieren bij temperaturen hoger dan 25°c leidt tot een verhoogd 3-HBZ gehalte (12). Bewaring van bevruchte eieren bij een

~~mperatuur

lager dan 25°c en van comsull]_-ptie-eieren in het -al_gerileen

-

~.!2-

­

.

(

..

1 5

-7. Literatuur

1. EEG-verordening nr. 2772/75 van de Raad van 29 oktober 1975 2. PBO-voorschrift E-5b, art. 1 en 6, I id 2 en 9

3. Csuka, J:, Noyy_, .J. en Ji rosová, Z., Br. Poult. Sc i.,~( 1_973)203

..

4. Harwalkar, V.R., J. lnst. Can. Techno!. Aliment., J_ (1968) 150

5. Cattaneo, P. , Neri, M. en Cantoni, C., lndust.Al iment., ~(1979)31

6. Salwin, H., Staruszkiewicz jr., W.F. en Bond,- J.F., J. Assoc. Off.

A na 1 . C hem. , 5 5 ( 1 972) 4 58

7. Staruszkiewicz jr., W.F., Bond, J.F. en Salwin, H., J . Chromatogr. 2J_(1970)423

8. Staruszkiewicz jr., W.F. en Starling, M.K., J. Assoc. Off. Ana1. Chem., ~(1971) 773

9. Robinson, D.S., Barnes, E.M. en Taylor, J., J.Sci .Food Agric., ~(1975)91 10. Heaney, R.K. en Curtis, R.F., J. Sci. Food Agric., ll(1976)1057

11. Jones, J.M. en Ell ingworth, C.E., J.Fd.Tec.hno1., ~(1979)199 12. Thomas, N.L. en Stock, S.W., J.Fd.Techno1., _!1(1982)649

13: Littmann, S., Schul te, E. en Acker, L., Z. Lebensm. Unters.Forsch.,

1 7 5 ( 1 98 2) 1 0 1

14. Parry, A.E.J. , Robinson, D.S. en Wedzicha, B.L., J.Sci .Food Agric., l1_(1980)905

f

15. E1enbaas, H.L., Haasnoot, W., Muuse, B.G. , Rutjes, B., Stouten, P.,

Steverink, A:T.G. en Uijttenboogaart, Th.G., te publiceren in: J.Agric. Food Chem., 1985

16. Haasnoot,· W., Stouten, P. en E1"enbaas, H.L., De Ware(n)-Chemicus

~(1984)40

17. Uijttenboogaart, Th.G., Steverink, A.T.G. , Elenbaas, H.L., Haasnoot, W., Muuse, B.G., .Rutjes, B·.--erÎ St:outen-1 P-~-.-_-t:e·:_pub.li_ce.ren _in .,J_,.Agric.