Bepaling van thiophanaat in vlees

Afdeling Diergeneesmiddelen 1984-10-17 RAPPORT 84.97 Pr.nr. 505.0600 Onderwerp: Bepaling van thiophanaat in

vlees Bijlagen: 5.

Verzendlijst: direkteur, sektorhoofden, direktie VKA, afdeling Dierge-neesmiddelen (4x), afd. Normalisatie/Harmonisatie

(Humme), Projektbeheer, Projektleider (Aerts)

Afdeling Diergeneesmiddelen 1984-10-17

RAPPORT 84.97 Pr.nr. 505.0600

Projekt: Ontwikkeling methoden voor het aantonen en bepalen van dier-geneesmiddelen op niet microbiologische wijze

Onderwerp: Bepaling van thiophanaat in vlees.

Bijlagen: 5

Doel:

Het bepalen van thiophanaat in vlees op residu niveau met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie.

Samenvatting:

Er is een analysemethode voor thiophanaat in vlees op residu niveau ontwikkeld. Door toepassing van een Seppak Silica cartridge (Waters) bij de voorzuivering, kon de opwerking zeer kort worden gehouden. Het behulp van een "diode array" detector kunnen positieve monsters ~wrden geïdentificeerd tot een niveau van 15 ppb.

Conclusie:

De ontwikkelde methode bleek goed te voldoen op een niveau tussen 10 ppb en 1 ppm. De onderste grens van aantoonbaarheid bedraagt ca. 5 ppb. Het terugvindingspercentage meer dan 80%.

Verantwoordelijk: drs H.r-t.L. Aerts Hedewerker/Samensteller: W.M.J. Beek Projektleider: drs H.M.L. Aerts

8497.0

Inleiding

Thiophanaat is een anti-wormmiddel (anthelminticum) dat o.a. wordt toegepast bij varkens en schapen. Thiophanaat is toegelaten als geme -dicineerd voeder voor varkens.

Er wordt bij varkens een wachttermijn van 28 dagen aangehouden voor het slachten.

Het gebruik ervan kan aanleiding geven tot residuen in vlees. Tot op heden is voor vlees geen analysemethode gepubliceerd. Er is daarom getracht met behulp van hogedrukvloeistofchromatogra -fische analysetechniek een methode te ontwikkelen op residuniveau voor vlees. 2. Structuurformule Thiophanaat. ~ _{NHCSNHCOOC 2H5}

~

NHCSNHCOOC2H5 Handelsnaam Nemafax. 1, 2-Bis(3-ethoxycarbonyl-2-thioureido)benzeen.

Het witte poeder is oplosbaar in aceton, methanol, chloroform en ace-tonitriL

3. Beschikbare analysemethoden

Voor de bepaling van thiophanaat in vlees op residuniveau zijn in de literatuur geen methoden beschikbaar.

De toepassing van thiophanaat als anthelminticum wordt ,.,el beschreven (ref. 1).

Thiophanaat wordt in voeders bepaald met hogedrukvloeistofchromato -grafie (ref. 2).

Laatstgenoemde techniek is dan ook het meest aangewezen voor de ana-lyse van thiophanaat op residuniveau.

2

-4. Ontwikkelen van een methode ter bepaling van thiophanaat in vlees

4.1 HPLC

De "reversed phase" hogedrukvloeistofchromatografie is de meest aange-wezen techniek. De scheiding van thiophanaat op een kolom met C18 materiaal bleek vrij moeilijk te zijn. Thiophanaat is in vele eluentia niet reproduceerbaar op te lossen.

Een eluensmengsel van 0,025 molaire kaliumdihydrogeenfosfaat en aceto-nitril bleek te voldoen.

Hiermee kan thiophanaat reproduceerbaar geanalyseerd worden op een Cp Spher C18 (250 mm lengte x 4,6 mm ID) met een eluenssamenstelling van 600-400 0,025 NKH2P04 - acetonitril met een elutiesnelheid van 1,5 ml/min. De maximale absorptie van thiophanaat in het eluens bleek bij ca. 263 nm te liggen wat bepaald werd met een "diode array" detector. De analyse kan het beste geschieden met een variabele UV-detector bij 263 nm. Voor de bepaling van de lineariteit tussen concentratie en detectiesignaal \o~erden oplossingen van thiophanaat in eluens ge'injec-teerd met concentraties tussen 0,5 ~g/ml en 12 ~g/ml. De regressie-coäfficient bedroeg 0,99945 wat betekent dat een redelijke lineariteit gewaarborgd is.

4.2 Extraktie

Thiophanaat lost goed op in chloroform maar dit geeft als extraktie

-middel bij vlees vaak emulsies. Daarom is gekozen voor dichloormethaan.

De oplosbaarheid in dichloormethaan is redelijk en er ontstaan minder emulsies.

4.3 Zuivering

Er is in de literatuur weinig bekend over de analyse van thiophanaat. Voor de zuivering van het extrakt kan men vloeistof-vloeistof

extrak-tfes toepassen.

Deze zijn in de praktijk vaak arbeidsintensief. Er is getracht een zo kort mogelijke zuiveringsstap te ontwikkelen.

Het gebruik van Seppak silica cartridges (Waters Ass.) in de clean-up fase is bij andere applicaties reeds toegepast (chlooramphenicol in vlees). Ook voor de bepaling van thiophanaat als residu in vlees is getracht Seppak in te zetten bij de zuiveringsfase. De beste methodiek bleek te zijn, het extrakt in te dampen tot droog,

-- 3

-het residu opnemen in een petroleumether-dichloormethaan 2-1 mengsel, het mengsel op een Seppak silica kolommetje brengen. Hierna thiopha-naat van de kolom elueren met een dichloormethaan-methanol 95-5

mengsel. Na verdampen van de oplosmiddelen het residu opnemen in HPLC eluens. Deze waterige fase zuiveren met iso-octaan en daarna analy-seren met "reversed phase" HPLC.

5. Bespreking

5.1 Recovery

Het de genoemde procedure werd vlees onderzocht door bekende hoeveel

-heden thiophanaat te adderen aan blanco materiaal op 10 ppb tot 1 ppm niveau. Vlees Recovery (%) Blanco vlees

+

0 ppb Blanco vlees

+

9,1 ppb 81 Blanco vlees

+

18,2 ppb 86 Blanco vlees

+

45,5 ppb 83 Blanco vlees

+

91 ppb 82 Blanco vlees

+

182 ppb 87 Blanco vlees

+

273 ppb 91 Blanco vlees

+

455 ppb 81 Blanco vlees

+

910 ppb 98

De gemiddelde recovery bedraagt 86% met een standaarddeviatie van 5,9%.

5.2 Analyse

Bij de HPLC analyse dient het chromatagram zo schoon mogelijk te zijn. In het chromatagram is na de thiophanaatpiek nog een andere piek waar-neembaar, weliswaar gescheiden van de piek van interesse.

Afhankelijk van de kolom dient het eluens iets aangepast te worden.

5.3 Identificatie

Identificatie van thiophanaat in bekende en onbekende monsters is mogelijk met een diode array detector.

-- 4

-Tot op 10-15 ppb niveau is het mogelijk om door vergelijking van het

absorptiespectrum thiophanaat te identificeren.

6. Conclusie

De ont1~ikkelde methode bleek goed te voldoen op een niveau tussen 10 ppb en 1 ppm. De onderste grens van aantoonbaarheid bedraagt ca. 5 ppb. Het terugvindingspercentage meer dan 80%.

Literatuur

1. Field studies with in- feed medication of pigs in the Netherlands using the anthelmintic thiophanate with particular reference

against Ascaris serum.

P. Evans and L. van Leengoed.

The Veterinary Quarterly, vol. 6, no. 1, January 1984, pp. 27-30. 2. Voorlopig intern analysevoorschrift (1e oplage, 1982-08-16)

Bepaling van thiophanaat in voeders.

Bijlagen:

1. Chromatogram blanco vlees.

2. Chromatogram vlees (18,2 ppb). 3. Chromatogram vlees (91 ppb). 4. Absorptiespectrum thiophanaat.

5. Intern analysevoorschrift - Vlees - Bepaling van thiophanaat.

1-, ·" Á,.." ·~ ' ' I \·

•

-- ~f--1:-

1-____:__:__-_-

_

_

__

-~·=-

-

---

-=-

·-.-

--

~- --~--

·

-:_

.::-=-_·.:: :._

j

·-fJ:

-

..

·-·-

·

-

-

·

·--- ·--- ·--- ·---

--

-

-

-

--

-

-

--

- - - -

-

-·

--

- --

-

f-

---

-

--- --

- --- -_

--

---

·-

- -- - - - -- --M- - -~-

_···.--:_-: .

• ,

::--

~-== --·-:::·_-

__

-

-- --

'· _ ___.::= - ----·- ---·- - - - --- - -·---

t=1"1=

-

-- -· - - - -- --- ---- -- ---· --- · · - i-H- ·- 1 -1l

~

==

·

=E-==t=

=

=t=

=

~=

=

-

l

=

·

==

.__,

-

f=

-- --

·

-

··

-

-- ·

-

--

- - ·

-

-

- -

---·-

- -i

1

-

·-

TI

H-

~

11 · - -- · - -- -- - -- --- - - m·... . -~--

_{--- •}

--~----~

_·

_-

_·

--

_-·

_-

_=-=-

-~--

_{. --}

-+-

_{--- ----}

--1----~--

_---·

·c

___

=-

_-

_---

-

~

'

-,..=.:._ • 1- - - . - ·- ~· ' I • - - - -_-__ -1-_-_-+---4--~L--. ---- - - ·- 1 -IJ. · .:::-·-- - - -- --- - 1- .

+-

_

__

-1_ ---+-- -+-

---

_-+

-- -- - ·'-· - ·-

--- · . - - · - -1-- - - · --- - · -____ ..:_~---_--__ -J-__ -H!-_-+1_--+_1.-_+_·~·- -··- --

-- --

--

- -- --- -

--

·

----

-

-

--· --. -- --- -- --. -- -~- . b- . f-,

_

- -

t-

.

_

-

_-

-

~

-~-

f

-_

-- 1-

---_

-

-l

-+l--

--~-

-

-=-

-::

=~=

--+

_

_

---~

_

+-

=

·

-

1==

·

=t-~

=

J=t)

.~

-=

~~

~

§~3

~

~

t -

~

~~~-

-

-

~

-

J~§~~

~

~~~

~

~==

~-

~-

~

~-~

=

-t

=t-~

~

~-~~

t

-

=-

=

-

=t

-·

tt

-

~-

1

==

-·==~=

-

---

j

=

~

==

~-===~==

-= ·- · - - --=- --- --- ·- ·-·- . - -- - . o · . -:- - -. rw

-

-1---=t....--:-

·

-= ---

-

- --

-·-

,_ - I- - -- - -

-

---,-+---

-+

l===:j==~-=~-

-

·-

_

.:__

_

_

_ -.

-- f -- - --- ":-11-~=-

.-.

-

_

-

.-. --+- -+-

-~

==

±==±

==

_-

r==

·

-

.

_{- - - - -·}

·-

_{-- -· - -1- -· -} - -r--· -- - - - j ~----~-

-:.:::::

=-:..::=-t.:

==t

=

- - - · --!-· .- ·

-~

~~-

~

4

~

-~

-

~

-

~-a-f~

~-~-~--

3

_{· -}

-

~f

~~-

-~-

r

~

-

(~ -

31

-~~

~

~-~~Ë

_-

·j

· -~-

_·-

!

·

1

-~-~-,--~

-

~

-

~~

~~t.

~~

:-::IS:

~

1

-

- -

---

-

-

-

-

_-

-i

_---11

lt.::

==

=t==

=~--=

-:-_-.=.- --- - - - ·-

::::--

~~

=

-.=~~-

i=

.

~vfit.-\vt

._

==

__

=t

==

.

=

__

=_t-==

·

=-+::-:

·...:

-

=t~

.

=

-

=

_

=

-

===

~~

==

-

---=

----1- -=-~=

.::

· -.:.

-

:=~-== -~= =---..:.~\)

.._,

-:::::::- __

-:_·:._-~

_

_

.:._~

·-

r ---- ·· · --- · · --- - ·· · . tv ... · ·· n · · - -· ----j-- -- .. - --+ 1\ --I· -- _ÇQ_ - · -·-

-1==

-

-

_-r--

- -1-

_,

-

_{_}

-

_·

-

_---

- -

_-

-

_-

- - -_--J-( _-J..A - ~ ~ _- ~=-_{·- - -- - - -}

--

--

_-----·--·- _{- ·}-_- f -_-- --+_- -l- /----\ ... ·- .. ---::::-.:::-'1\. -;;:-1\- ~-- ·-- --

=-==

~:::-==

---

·--

·---=-=

- -- -f--:--[\d-·· ~--~~~ '"'"'

v

·

·

·-

--·

-·-

-

·-

-

--- -

.

.

-

-

-

·---

_.

f

_

~-

-

-

- .

:J

~~

-

,-

-

~

=

-=

I

:c=

:--"

cC=

=-

_

-

:_

~

~

:

~

- C~-

: --

~

_

~

-:-

~3

c

.:::·.::_

-·

--

=-=

+-:-

.

::.:...~_-

-

·=

:..:.

-

---'---

=-==

_==..,

.:..::.:-_-

--=-=~

· -

-

-

-··- - - -· --!.. ·- · - - · - - - -

-

-

·-- -

-1-j : ._ ;, • i i.. l'c .'·

•

--- -·-:- - - · - . - -4- --+·-- . - - - -···-·- · - -1--- --- -

~

- - ----I-":.

-:==l===t

== -

-

'

.

.

I --- ···--·- - -- . --·- - -- ·· !-~~ . - - - --- - -- ---- --···· --- - ··- - -·-'- --<-. -- - ---+- - - 1 - - -- ---

--

- - - - -

-

·

:::~~-:: ~ ,~--:=-:;---::~~it.r ~ w~rU.:N"J:-:1~:-.:=

=;;;

---

:

~- ~-

·

- - - -

---- ,.-·- - - · - - -- ·- - - -·-- -··-·. ----·- ---- ---- -1- -

I'B

-:2,- --~--:rF: - .,,., - - - - --- +- --i! _:,_ - - -:~---__ _ l , __ :.=..._ //_ __ -~ :'_filH~I9~ _ _:=._.=._-:-__ . ___ .=-___:::--_. ~=-=·

:

=

=

·

-

_

. --:_

:

_

___

:..::=

__

- - - -+- - ...+- - - + - - --f----.-:--i-- - - 1 - --+-- - + -- --- - - -- -'.,.- - - t - ---t- - -

+-·=

-

--

=---

J

,l•

i.:.-~.:_ u~ ~-b.i

·

nm~ ::-~:-~---

".

JY1 ~are..:.:::-:-:::

...

..:.:-:.::~-~

;

·

~~-= _{·- - - -·}

-- . ·-o - -- -- --~; _·· -- --- - --- - - -- --- - - - -~"-- ---- - - -- :-i'· - - --- ·-- - · --- --- - -- - - -- ·- -- ---- ---- --7-

----

--

-

-

·--i- - -t---· --- -_ -__ - - - -- -··-!---·- - - · -- -- -- -- --· ·- -- : ' -·- -- 1- -- -- · -- -- - · - - - -- ,--; -- - --·- - - ··- - - -- :-~+-. - -- - · -·-f----+- -.- - --- -- - --:::::. ::;::· r ='

Ulj'

--=-:·

.=...·

=t-

-

·

-==+

==t-=

-

-

- - - - -- ·- ; . ~-;---·-

-

· -- -·-

-

-

_-

- --:-,-;-

_--

1 -

-

-

f--·-

'lt

·- - o- ·- · -

q .

··--- · -

--

+

-

H-

=

· -· -- ·-

-- --+- - -1--- -+----+-- -+·----t: __

·

·

=

·-

--~~----!=

=:-

.:.

-t+

.j.;..:

+_-.--~- ~-·- __ .w._ _____ :..:::----+--+---41_---~---fr---+---t----1- --~- r===:---·--t=·---==t:~~-==t==

~

~~~~

~

~~~~~~

-~--~-

j-1--

~~-

-

-~

~~-

. --

-

-·

- - -

-

·

-

--

- -

-1-

--

-f

'

- -

-

--· -

- -

-.

-1--~-- ri.+----11-- ----

--

-

-

-

-

·-

---~·:

=t==++l=

=+=

·- --·- ·- · -- -- --- - -- --··-- -·- ·--·- . ---· ... - --. -- .. ·o - - -·--

·

--,

··---UJ ' l .. -- - ---+ - - - l - - --1- - - -·· - ·· --· --- - --- - -+---1--f- - --- ... __

-

·

--+

- -- --+ -- -- - 1 - - -- 1 - -- - - l - -··- -· - ·-- -· - -

·

--n

1

=~=-=-

·-

·-

--

---r--

---l----t----_+t_::-~~_::_::~·=-==-.. -+-_:_:~.~---:_---t-_H--_+_-J~41= ----·-=-. ·-. . - -·- - · -+-- ·- 1-- -1-iH- · -· - 1 - - _{- + -- · ·} - - · -_{- -- ·.} ·

---r

~~~

~

~F-

~~ê~

§

~

· - . - - - -- ·- 1"'1- -- - 1 - - · --

-:---:-:-

~-~

=

1=-

-

~

---=.= _·

-~-.-

~ ~~~_-_:_~-~

~1:

-

:-~

-

~j

(

~

~

---~

.·

·-

-=

:-.~-

·=I==~

1- t --·-t--- - ·- -

1

-

/

'~:··

-

fj

..

\~

--r:-

-

--·

...

-~fiJJ_!T.

'fl

-·.-.:.

·· __

_

~-:...-

-

··

-

-

-·--

·

-

-

1-===. -

-

-._r5k . .:::: -

~=-

~;(

~

::=::.

.

~~

.

...

<

'~

-

.

-.-.-

-=:=-

.

~-~

~--~=

=~-

~-=

-..=.__

-

-I==

=

:::-.:.:.~=1-_~_-

__

·:...·

::.___..:.::::;

·_...=;--=-===

-~-==-

--::-..:.

:=

-~~

-.

:=..

--

=-:...-

_-

-~~-=-.:..._ ---:.- ·- ·- - ~-

=

- - - -.- - - ; ·---' -1-- --· - · - - - -·--o- - -·-1--· - - .. . . -- - -;. -· - - - . ·--- - ___ ... - ·--- -·· - · - . .Y! .. - --·-- ·-· ----==~

-

-

-

::-:-=-_-:-:

·

==1

=-

=-==-~-

·-

-

--

-

.~:::

==

--

~=-~·--

.

:

.:.._

.

.-

:

--~=-~

--·-

. -

-

-

··-·-·---:- .

_

__;_ ---...

-

- - .. --· -~ - . - ---- - -·-

-

. - · -

-L:

~·

·.

j L .' ( !' t ·-~" \ ~·

(

( Jlt __ _ J _ _ _ ! : ·

-

--- -.:: - - - --=t' -- --- - - 1- - - - -~ - - ---1- ----lf--- - - - -- - -- -- -- -- -- -- ---+----1- - 1- -_ ----1~ __ -_-_----+--==+-_-l---11_ ---l---11---+--,---~---4---1---+---l----+-~-~R - - -+- -

----

---

===--=l~===t===l===l==--~= _{- - -}

--

-

-

_{--- -}

-

-

_-

-

-

--_{- - - -}---1---1---1~ _{- - -}- - -1 . -- ---o--+- -- - --c -.;r 1- ~ ----+----1--- l---1---1---1---~--- - - - --1~--

-- ---1- -- --t- - - -t--- -1- - - -- - - ---+----+-~---m"i--=-1=-- - - -

-===---- --

-

- -

--=---:

_

_:_ _ _

'!?

-

-=--=---=---

---=--= -

-

-

- 1- -~---o -

-=---i

-c--~--- - - - - --- - - _--

- -

-~--

--

--c - - -~)---1;-f--- - - - - --- --- --- --- --- --- -~- - ----1-1- --11 -- --- - 1--- 1 ---~-~-- - ~---- - - 1

-===-

-

-

--=

-

i-=~=---1---1----1----=

-__

_

--

-

-

-

,J

-

1-

-_ -_ -u - ·----+---~--- - - - -

-- o - - - --- - _--c UJ - ---- - --+-- --1-+1 - - - -1- ----1- -1---- -1--- - - --1-- -+ -- ---1- -- 1-+ - - -- - -- - - -- ---~ - - -1-- - -1---1-- l- --11-

-- -- -- -- --

-

- -- -- -+- - - 1-

- - - - -

____

,

__

_

- -o -I- l - --- r--- - - -f-·

I/

---..; --.... _

.

:::.

~

-

..._

--~---

-filil

Catas

Spactn.lll

l:linla

RafQMrlea

fll1n1a

Attn taAlD

a

9 0% -

AbsorbalcQ [mAlJ) ( l'nl] )a

[mAUJ

0

RAWDAT

08/01/1984

12. 3112

13.3025

36.3

31. 1 (263/ 2)

hp 1040A -lo.o~~~~~--~~--~~~~~~~~~~~~~~~~~--~~

Wave l e

'

_

g t h [nmJ

/

Afdeling Diergeneesmiddelen

INTERN ANALYSEVOORSCHRIFT A 358

1 e oplage (1984

-os

-Q6)

VLEES - BEPALING VAN THIOPHANAAT - HPLC

( I

Verzendlijst: bibliotheek (5x), sektorhoofd, afdeling Diergenee

smid-delen (4x).

I~~ERN ANALYSEVOORSCHRIFT A 358

1 e oplage (198~ -oS-06)

Vlees - Bepaling van thiophanaat u HPLC ·

1.

Doel en toepassingsgebied

..

Het de methode kunnen residuen thiophanaat in vlees worden bepaald.

De onderste g:rens van aantoonbaarheid bedraagt ca. 5 ppb. He.t terug-.

vindingspercentage bedraagt meer dan 807.. Eet toepassingsgebied ligt

tusseTI 10 ppb en 1 ppm.

2. !!_inc:l~

Thiophanaat wordt met behulp van dichloormethaan uit vlees geextra-heerd.

Na verdampen van de dichloormethaanfase wordt het residu opgenomen in

een petroleumether-dichloormethaan mengsel.

Het mengsel wordt op een Seppak silica cartriàge kolom gebracht.

Thiophanaat vordt van de kolom geelueerd met een

dichloormethaan-methanol mengsel. Na verclampen van

de

oplosmiddelen wordt het residu

opgenomen in HPLC eluens. De waterige HPLC fractie wordt gezuiverd met

iso-octaan en daarna geanalyseerd met "reversed phase" HPLC.

3. Reagentia

Alle reagentia dienen van "pro analyse" kwaliteit te zijn of anders

indien vermeld. ·

3.1 Dichloormethaan (b.v. Merck 6050).

3.2 Petroleumether 40°-60°C (b.v. Merck 909).

3.~ Methanol, Lichrosolv kwaliteit (b.v~ Herck 6007).

3.4 Hillipore water.

3.5 Kaliumdihydrogeenfosfaat (b.v. Herck 4873).

3.6 Acetonitril, Lichrosolv kwaliteit (b.v. Herck 30).

-3.7 Iso-octaan (b.v. Merck 4727).

3. 8 Petroleumether-dichloormethaanmengsel 2 -1

Meng 200 ml petrolemuether met 100 ml uichloormethaan •

•

3.9 Dichloormethaan-methanolmengsel 95-5 Meng 95 ml dichloormethaan met 5 ml methanol.

3.10 HPLC eluens

·

o,

025 M KH2P04 - Acetoni tril 600-400

Los 3,4 g kaliumdihydrogeenfosfaat op in millipore water en vul aan tot 1000 ml en meng.

3.11 Seppak silica cartridges (art. 51900; Waters).

3.12 Natriumsulfaat (b.v. Merck 6649).

3.13 Filtreerpapier GFH

I>

15 cm (Whatman). 3.14 Thiophanaat (Ethyl) standaard.

3.14.1 Thiophanaat stamoplossing

Weeg op 0,1 mg nauwkeurig ca. 50 mg thiophanaat af in een 100 ml maatkolf. Los op in methanol, vul aan en meng (oplossing

A).

3.14.2 Thiophanaat verdunde oplossing

Pipetteer 10 ml van de stamoplossing in een 100 ml maatkolf. Vul aan

met methanol en meng (oplos~ing

B).

Pipetteer 5 ml van deze oplos~;ing (B) in een 100 ml maatkolf. Vul aan

met dichloormethaan en meng (oplossing C).

Pipetteer 10 ml van deze oplosslng (C) in een 100 ml maatkolf. Vul aan met dichloormethaan en meng (oplo.ssing D).

3.14.3 HPLC standaardoploss:i.ngen

Pipetteer resp.

2, 5

en 10 ml van oplossing D in afzonderlijke cultuurhuizen. Damp ·droog met stikstofstroom. Voer dit ook uit met

oplossing

c

..

358.2 - 3

-r

I

Los het residu op in precies 1,0 ml RPLC eluens (maak gebruik van V i bro-fix).

De verkregen oplossingen bezitten concentraties van 0,5 ~g/ml tot 25

~g/ml.

...

4. Apparatuur en hulpmiddelen

4.1 Vleesmolen (b.v. Moulinette).

4.2 Ultra-Turrax met 18 N Gtaaf.

4.3 Rotatievacuumverdamper.

4.4 Stikstofstroom.

4.5 HPLC !socratische opstelling met variabele UV detector en Cp Spher

C18 (250 x 4,6) 10 ~kolom (Chrompack 28512).

4.6 Vibro-fix.

4.7 Normaal laboratoriumglaswerk.

5~ .Werkwijze

5.1 Voorbereiding

Maal het vlees ·fijn in een vleesmolen. Weeg hiervan 2 5 .g af in een

.bekerglas van 250 ml.

5.2 Extraktie

Voeg toe, 150 ml dichloormethaan en meng het geheel 3 minuten met een

Ultra Turrax. Filtreer de organische fase. over een filter (GFA) met

daarop 25 g natriumsulfaat in een indampkolf van 500 ml.

Herhaal de extraktie nog twee maal met telkens 100 ml dichloormethaan.

Verdamp de verzamelde dichloormethaanfracties op een

rotatievacuumver-damper met badtemperatuur van 40°C tot olieachtig residu.

-5.3 Zuivering

Los het resid~ op in 25 ml petroleumether-dichloormethaan 2-l mengsel

(extraktiemengsel).

Sluit nu het korte einde van een Seppak silica cartridgekolom aan op

een 50 ml wegwerpspuit.

•

Breng hier 5 ml zuiver petr.oleumether-dichloormethaan 2-1 mengsel in

en pers dit er langzaam door (voorbewerking).

Breng nu de 25 ml petroleumether-dichloormethaan extractiemengsel in

de spuit en spoel de kolf na met

5

ml zuiver

petroleumether-dichloor-methaanmengsel en breng dit eveneens in de spuit.

Pers het mengsel (30 ml) nu langzaam door de kolom. Breng 10 ml zuiver

9etroleumether-dichloormethaanmengsel in de kolf, zwenk, en breng het

in de spuit. Pers het geheel langzaam erdoor en herhaal het nogmaals.

Leid via het korte einde van de cartridge gedurende 20 minuten

stikstof door d-~ kolom. Koppel deze daarna van de stikstofstroom en .

laat de cartridge 20 minuten op kamertemperatuur komen.

Verbind het korte einde van de cartridge met een 10 ml spuit (Teramo

wegwerp) en pers 8 ml dichloormethaan-methanol (95-5) ml door de

cartridge in een 10 ml cultuurhuis.

Damp de inhoud droog met een stikstofstroom bij ca. 30°C.

6. AnalyseoE_lossing .

Los het residu op in precies 1,0 ml HPLC eluens en voeg 2 ml

iso-octaan toe.

Sluit de buis en meng 15 seconden op Vibro-fix. Laat de fasen scheiden

en verwerk daarna de bovenstaande iso-octaanfase. Filtreer de

onder-staande waterige oplossing door een 0,45 ~m filter • . Injecteer deze

analyseoplossing in het HPLC systeem.

7. HPLC instelling Analytische kolom Voorkolom Injectievolume Eluenssnelheid Detectie Eluens Retentietijd 358.4 Cp Spher Cl8 ~4,6 x 250 mm) 10 ~ (Chrompack). Bondapak C18/Corasil (3,9 x 20 mm) 37-50 ~ (Waters). 50 ~1. 1,5 ml/min. uv-263

run.

0,025 M KH2P04-Acetonitril 600-400. 10-12 minuten. 5 \

5

-Bereken het gehalte aan thiophanaat in het vleesmons.ter door

standaardoplossingen te vergelijken met monsteroplossingen.

7. Opmerkingen

7.1

Recoveryexperimenten

Pipetteer vanuit de oplossing C of D (3.14.3) een bekende hoeveelheid

in een bekerglas. Damp af met stikstof en voeg hierna vlees 'toe en

voer

Çe

bepaling uit zoals staat aangegeven.

7.2 Het eluens 600-400 0,025 M KH2P04-Acetonitril is ook toepasbaar op

Cp Spher Cl8 (3 x 200) cartridge met 0,6 ml/min elutiesnelheid.

Verantwoordelijk: drs H.M.L. Aerts

k.

Samensteller 'I-.1_{.M.J. Beek '"'· l3.}