Five new genetic loci involved in cell wall peptidoglycan metabolism of Escherichia coli

(1)

i S u p e r v i s o r : D r . E d w a r d E. I s h i g u r o ABSTRACT f i v e new g e n e s a p p a r e n t l y i n v o l v e d i n t h e m e t a b o l i s m o f c e l l w a l l p e p t i d o g l y c a n b y E s c h e r i c h i a c o l i a r e d e s c r i b e d . One o f t h e s e , d e s i g n a t e d mu rH, was m a p p e d a t 99 m i n o n t h e E . c o l i l i n k a g e ma p. Th e mu rH l m u t a n t e x h i b i t e d t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e ( t s ) g r o w t h w h i c h w as a s s o c i a t e d w i t h a b l o c k i n a l a t e s t e p i n p e p t i d o g l y c a n s y n t h e s i s a n d w i t h p e p t i d o g l y c a n h y d r o l a s e - m e d i a t e d l y s i s a t t h e r e s t r i c t i v e t e m p e r a t u r e . Th e murH l o c u s c o u l d n o t b e c l o n e d i n m u l t i c o p y v e c t o r s b u t was r e a d i l y c l o n e d i n a s i n g l e c o p y p h a s m i d v e c t o r d e r i v e d f r o m p h a g e k . Th e i n s t a b i l i t y o f murH i n m u l t i c o p y p r e v e n t e d i t s f u r t h e r c h a r a c t e r i z a t i o n . As a n a l t e r n a t i v e a p p r o a c h t o c h a r a c t e r i z i n g t h e murH f u n c t i o n , e x t r a g e n i c m u t a t i o n s w h i c h s u p p r e s s e d t h e mu rH l t s l y s i s p h e n o t y p e w e r e i s o l a t e d . One s u p p r e s s o r m u t a t i o n , d e s i g n a t e d smhAl , (25 m i n on t h e g e n e t i c l i n k a g e map) r e s t o r e d t e m p e r a t u r e r e s i s t a n c e i n mu rH l m u t a n t s b u t o t h e r w i s e h a d no d i s t i n g u i s h a b l e p h e n o t y p e . A s e c o n d e x t r a g e n i c m ur H l s u p p r e s s o r , smhBl (1 3 m i n ) , c o n f e r r e d a t s l y s i s p h e n o t y p e b y i t s e l f . I n t e r e s t i n g l y , a c o m b i n a t i o n o f m u rH l a n d smhB l r e s u l t e d i n c o s u p p r e s s i o n o f t h e i r l y s i s p h e n o t y p e s . The s u p p r e s s o r a c t i v i t i e s o f t h e smhAl a n d smhBl a l l e l e s w e r e r e l a t i v e l y s p e c i f i c i n t h a t t h e y f a i l e d t o

(2)

s u p p r e s s l y s i s c a u s e d by e i t h e r m u t a t i o n a l (murL o r m u r F ) o r a n t i b i o t i c - i n d u c e d b l o c k s i n p e p t i d o g l y c a n s y n t h e s i s . Two a d d i t i o n a l t s l y s i s m u t a t i o n s , l y t D l (ma pp ed a t 13 m i n ) a n d l y t E l ( 2 5 m i n ) , a r o s e s p o n t a n e o u s l y i n smhBl a n d smhAl b a c k g r o u n d s , r e s p e c t i v e l y . The smhAl a l l e l e s u p p r e s s e d t h e l y s i s p h e n o t y p e o f l y t E l b u t n o t o f l y t D l . F u r t h e r m o r e , t h e c o m b i n a t i o n o f smhBl w i t h e i t h e r l y t D l o r l y t E l r e s u l t e d i n c o s u p p r e s s i o n o f t h e i r l y s i s p h e n o t y p e ^ . The s p e c i f i c i t y o f t h e s u p p r e s s o r a c t i v i t i e s , c o m b i n e d w i t h t h e s i m i l a r i t i e s i n t h e p h e n o t y p e s o f t h e m u t a n t s r e p r e s e n t i n g t h i s c o l l e c t i o n o f l o c i , s u g g e s t e d f u n c t i o n a l r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e murH, s mhA, smhB, i y t D , a n d l y c E l o c i . F o u r c l o n e s w h i c h c o m p l e m e n t e d t h e l y t D l m u t a t i o n w e r e o b t a i n e d b y s c r e e n i n g a n E . c o l i g e n e l i b r a r y , b u t i t i s shown t h a t t h e c o m p l e m e n t i n g a c t i v i t y d i d n o t r e p r e s e n t t h e E. c o l i c h r o m o s o m a l I y t D l o c u s . I t i s shown i n s t e a d t h a t 2 p h a g e

X

g e n e s , i d e n t i f i e d a s c r o a n d c l , a c c o u n t e d f o r t h e l y t D l c o m p l e m e n t i n g a c t i v i t i e s i n t h e s e c l o n e s . E v i d e n c e i s p r e s e n t e d w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e s e c l o n e s w e r e d e r i v e d f r o m p h a g e A, DNA w h i c h was f o r t u i t o u s l y p r e s e n t a s a c o n t a m i n a n t i n t h e v e c t o r p r e p a r a t i o n u s e d f o r c o n s t r u c t i o n o f t h e g e n e l i b r a r y . S i n c e t h e

X

C r o a n d Cl p r o t e i n s a r e D N A - b i n d i n g p r o t e i n s w h i c h b i n d t o i d e n t i c l 17 b a s e - p a i r r e c o g n i t i o n s e q u e n c e s ( t h e

X

r i g h t o p e r a t o r s e q u e n c e s ) , i t i s h y p o t h e s i z e d t h a t LytD e n c o d e s a D N A - b i n d i n g p r o t e i n w i t h a s i m i l a r s p e c i f i c i t y ( i . e . , w h i c h b i n d s t o a A r i g h t o p e r a t o r - l i k e s e q u e n c e ) w h i c h r e g u l a t e s , p r o b a b l y

(3)

iv n e g a t i v e l y , t h e e x p r e s s i o n o f a g e n e ( s ) i n v o l v e d i n some way w i t h p e p t i d o g l y c a n h y d r o l y s i s . E x a m i n e r s : ,---D r . E . E . I s h i g u r o , S u p e r v i s o r ( ,---D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y & M i c r o b i o l o g y ) D r . W.W. K a y , D e p a r t m e n t s If Member ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y & M i c r o b i o l o g y ) D r . S. M i s r a , D e p a r t m e n t a l Member ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y & M ic r o bi /> I) o g y) D r . * D. B u r k e , O u t s i d e Member ( D e p a r t m e n t o f B i o l o g y ) D r . E x a m i n e r ( D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , V a n c o u v e r )

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Page A b s t r a c t ... i i T a b l e o f C o n t e n t s ... v L i s t o f T a b l e ... • x L i s t o f F i g u r e s ... x i i L i s t o f A b b r e v i a t i o n s ... ... xv A c k n o w l e d g e m e n t s . . ... x v i i CHAPTER I s INTRODUCTION ... 1 I . T h e C e l l W a l l o f E s c h e r i c h i a c o l i ... . ... 1 I I . E. c o l i P e p t i d o g l y c a n S t r u c t u r e ... 3 1 . G e n e r a l S t r u c t u r a l F e a t u r e s ... 3 2 . R e c e n t O b s e r v a t i o n on t h e C h e m i c a l C o m p o s i t i o n o f PG ... 7 3 . T h r e e D i m e n s i o n a l S t r u c t u r e o f PG ... 13 I I I . PG B i o s y n t h e s i s ... 14 1. B i o s y n t h e t i c P a t h w a y o i PG ... 14 2 . Th e PBPs a n d T h e i r F u n c t i o n s i n PG M e t a b o l i s m ...„ ... 18 3 . PG H y d r o l a s e s a n d T h e i r R o l e s i n PG M e t a b o l i s m ... 22 IV. M e c h a n i s m o f A u t o l y s i s ... 27 1. I n v o l v e m e n t o f PG H y d r o l a s e s ... 27 2 . R e g u l a t i o n o f PG S y n t h e s i s a n d H y d r o l y s i s

(5)

Vi

b y t h e S t r i n g e n t R e s p o n s e ... 28

V. P u r p o s e a n d O r g a n i z a t i o n o f t h i s D i s s e r t a t i o n . . 30

CHAPTER 2 : MATERIALS AND METHODS ... 33

I . B a c t e r i a , B a c t e r i o p h a g e s a n d P l a s m i d s ... 33 I I . M e d i a a n d C u l t u r e C o n d i t i o n s ... ... 33 I I I . D e t e r m i n a t i o n o f T e m p e r a t u r e S e n s i t i v i t y ... 34 IV . S o l u b i l i z a t i o n o f R a d i o l a b e l e d PG... 34 V. PG S y n t h e s i s ... 35 V I . G e n e t i c T e c h n i q u e s ... 37 V I I . G e n e r a l R e c o m b i n a n t DNA T e c h n i q u e s ... 38 V I I I . C l o n i n g M e t h o d s ... 38 I X . DNA S e q u e n c i n g ... 39 X. E x p r e s s i o n o f C l o n e d DNA ... 40 X I . S D S - P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s (PAGE) . . 42 X I I . S o u t h e r n B l o t A n a l y s i s ... 42 X I I I . D e t e r m i n a t i o n o f I m m u n i t y t o P h a g e X ... 44

CHAPTER 3 ; ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF murHl MUTANT ... 45

I . O v e r v i e w o f C h a p t e r C o n t e n t s ... 45

I I . B a c t e r i a , B a c t e r i o p h a g e a n d P l a s m i d s ... 45

I I I . R e s u l t s ... ... 45

(6)

2 . S i t e o f M u t a t i o n a l B l o c k ... 48 3. M a p p i n g o f t h e m urh L o c u s ..., ... 56 4 . C l o n i n g o f t h e murH Gene ... 58 5 . A t t e m p t s t o S u b c l o n e t h e murH Gene f r o m pDD41 ... 59 I V . D i s c u s s i o n ... 63

CHAPTER 4 : EXTRAGENIC SUPPRESSORS OF mu r H l : FOUR NEW GENES ( smhA, smhB, I y t D a n d l y t E ) APPARENTLY FUNCTIONALLY RELATED TO murH . . . 68

I . O v e r v i e w o f C h a p t e r C o n t e n t s ... ... 68 I I . B a c t e r i a l S t r a i n s ... 69 I I I . R e s u l t s : t h e smhB a n d I y t D M u t a n t s ... 69 1 . I s o l a t i o n c f t h e smhB M u t a n t ... 69 2 . I s o l a t i o n o f t h e I y t D M u t a n t a n d G e n e t i c s o f smhB a n d I y t D ... 74 3 . T e m p e r a t u r e S e n s i t i v i t y o f t h e smhBl a n d l y t D l M u t a n t s ... 76 4 . T e m p e r a t u r e - D e p e n d e n t L y s i s P h e n o t y p e s a n d L y s i s S u p p r e s s o r A c t i v i t i e s o f t h e smhBl M u t a n t ... 82 5 . O t h e r smhB- L i k e M u t a n t s ... ... 85 IV. R e s u l t s : t h e smhA a n d l y t E M u t a n t s ... 87 1. I s o l a t i o n o f t h e smhA M u t a n t ... 87

(7)

viii 2 . I s o l a t i o n o f t h e l y t E M u t a n t a n d g e n e t i c s o f smhA a n d l y t E ... ... 87 3 . P h e n o t y p i c P r o p e r t i e s o f t h e smhAl a n d l y t E l A l l e l e s ... 93 4 . N a t u r e o f t h e R e l a t i o n s h i p B e t w e e n smhA a n d l y t E ... 100 5 . P r e l i m i n a r y C h a r a c t e r i z a t i o n o f A d d i t i o n a l murH S u p p r e s s o r M u t a n t s ... 101 V. D i s c u s s i o n ... 102

CHAPTER 5 : SUPPRESSION OF THE l y t D l MUTATION BY THE PHAGE A c r o AND c l GENES ... 112

I . O v e r v i e w o f C h a p t e r C o n t e n t s ... 112 I I . B a c t e r i a , B a c t e r i o p h a g e s a n d P l a s m i d s ... ... 116 I I I . R e s u l t s ... 116 1 . A t t e m p t t o C l o n e t h e I y t D Gene ... 116 2• l y t D l c o m p l e m e n t a t i o n b y t h e P h a g e A c r o Gene ... 116 3 . D e m o n s t r a t i o n o f t h e c l Gene i n pDD51 ... 130 4 . C o m p l e m e n t a t i o n oC l y t D l b y t h e A c l G ene . . 135 5 . A t t e m p t s t o Com plement O t h e r M u t a t i o n s w i t h c l a n d c r o ... 137 IV . D i s c u s s i o n ... 137 REFERENCES 149

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LIST OF TABLES Table Page 1. E. c o l i K-12 s t r a i n s , b a c t e r i o p h a g e a n d p l a s m i d s . . 46 2 . C e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f [ 3H]DAP i n c o r p o r a t e d b y VC462 ( m u r H l ) a t 30°C a n d 42°C ... 52 3 . A n a l y s i s o f l i p i d i n t e r m e d i a t e f r a c t i o n s o f s t r a i n VC462 ( m u r H l ) ... 54 4 . E. c o l i K-12 s t r a i n s ... 70 5 . T h r e e - f a c t o r c r o s s a n a l y s i s f o r z b c - 1 0 3 ; ; T n l O , zb c - 1 0 4 : : T n l Q y p u r E , a n d I y t D ... 77 6 . C o l o n y f o r m a t i o n b y i s o g e n i c murHl smhBl a n d l y t D l smhBl s t r a i n s a s a f u n c t i o n o f g r o w t h medium a n d t e m p e r a t u r e ... 79 7 . C o m p a r a t i v e s u r v i v a l o f i s o g e n i c murHl smhBl a n d l y t D l smhBl s t r a i n s a t 42°C on NA ... 81 8 . E. c o l i K-12 s t r a i n s ... 88 9 . T h r e e - f a c t o r c r o s s a n a l y s i s f o r z c e - 1 0 2 : ; T n l O , z c e - 1 : : T n l 0 k a n , a n d s m h A ... 92 1 0 . C o l o n y f o r m a t i o n b y i s o g e n i c murHl smhAl a n d l y t D l smhAl s t r a i n s a s a f u n c t i o n o f g r o w t h medium a n d t e m p e r a t u r e ... 94 1 1 . C o l o n y f o r m a t i o n b y i s o g e n i c l y t E 1 smhAl a n d l y t E l smhBl s t r a i n s a s a f u n c t i o n o f g r o w t h medium a n d t e m p e r a t u r e ... 95

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X 1 2 . E . c o l i . K- 12 s t r a i n s , b a c t e r i o p h a g e s a n a p l a s m i d s ... 117 1 3 . l y t D l c o m p l e m e n t a t i o n a c t i v i t y o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d s i n s t r a i n VC4014 ( l y t D l ) ... 126 1 4 . A. i m m u n i t y a s s a y o f s t r a i n s DH5a ( I y t D * ) , a n d VC4014 ( l y t D l ) c a r r y i n g d i f f e r e n t p l a s m i d s ... 133

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LIST OF FIGURES Figure Page 1. G e n e r a l f e a t u r e s o f E. c o l i p e p t i d o g l y c a n ... 5 2 . C h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e m o n o m e r i c s u b u n i t o f p e p t i d o g l y c a n i n E. c o l i ... 6 3. Th e p r o p o s e d m u l t i l a y e r e d s t r u c t u r e o f p e p t i d o g l y c a n i n E. c o l i ... 11 4. M ain s t e p s i n p e p t i d o g l y c a n b i o s y n t h e s i s i n E. c o l i ... 15 5. C l e a v a g e s i t e s o f E. c o l i p e p t i d o g l y c a n h y d r o l a s e s ... 23 6 . T e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t a u t o l y s i s o f s t r a i n VC462 ( m u r H l ) ... . 49 7. E f f e c t o f g r o w t h t e m p e r a t u r e on p e p t i d o g l y c a n s y n t h e s i s i n s t r a i n VC462 (m u r H l ) ... 50 8 . L i n k a g e map o f t h e murH r e g i o n ... 57 9. R e s t r i c t i o n map o f t h e ASE6 murH* t r a n s d u c i n g

p h a g e (pDD41) DPA ... 60 10. E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f t h e i n s e r t s i z e i n t h e s u b c l o n i n g o f t h e 11 k b BamHl f r a g m e n t o f pDD41 ... 62 11 . P r o c e d u r e f o r i s o l a t i o n o f s u p p r e s s o r m u t a t i o n s smhAl a n d s m h B l , a n d t s l y s i s m u t a t i o n s l y t D l a n d l y t E l ... 7 3 12. L i n k a g e map o f t h e smhB a n d I y t D l o c i r e g i o n ... 75

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xii 1 3 . T e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t a u t o l y s i s o f s t r a i n VC4133 ( s m h B l ) ... 83 1 4 . S u p p r e s s i o n o f murHl b y smhBl ... b4 1 5 . S u p p r e s s i o n o f l y t D l b y brnhBl ... 96 1 6 . L i n k a g e map o f t h e smhA a n d l y t E r e g i o n ... 91 1 7 . S u p p r e s s i o n o f murHl b y smhAl ... 96 1 8 . S u p p r e s s i o n o f l y t E 1 b y smhAl ... 98 1 9 . S u p p r e s s i o n o f l y t E l b y smhBl ... 99 2 0 . I n t e r a c t i o n r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n m u r H l , l y t D l , l y t E l , smhAl a n d smhBl a l l e l e s ... I l l 2 1 . A p o r t i o n o f k g e n e s a n d t h e i r r e g u l a t o r y r e g i o n s ... 114 2 2 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f t h e i n s e r t s i z e o f f o u r t e m p e r a t u r e - r e s i s t a n t ( L y t D r ) r e c o m b i n a n t p l a s m i d DNA ... 120 2 3 . R e s t r i c t i o n map o f t h e 7 kb BamHI ( c r o * ) f r a g m e n t a n d s t r a t e g i e s f o r s u b c l o n i n g a n d DNA s e q u e n c i n g o f t h e A. c r o g e n e ... 122 2 4 . DNA s e q u e n c e o f t h e k c r o g e n e a n d i t s f l a n k i n g r e g i o n ... 123 2 5 . E x p r e s s i o n e n d l o c a l i z a t i o n o f l y t D l c o m p l e m e n t i n g p r o t e i n i n T7 RNA p o l y m e r a s e a n d p r o m o t e r s y s t e m ... 125 2 6 . C o m p l e m e n t a t i o n o f l y t D l - m e d i a t e d l y s i s b y t h e k c r o g e n e . ... 127

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g e n o m e s p r o b e d w i t h a 1 . 1 kb P s t l - H i n d l l l f r a g m e n t c a r r y i n g c r o g e n e ... 129 2 8 . S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s o f f o u r Ly t D p o s i t i v e c l o n e s p r o b e d w i t h a 1 . 1 kb P s t l - H i n d l l l f r a g m e n t c a r r y i n g cjc g e n e ... 131 2 9 . S t r a t e g y f o r s u b c l o i n g o f t h e

X

c l g e n e ... 136 3 0 . C o m p l e m e n t a t i o n o f l y t D l - m e d i a t e d l y s i s b y t h e

X

c l g e n e ... 138

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xiv Ampr Camr CFU CGSC CSH D - A l a DAP D - G l a DMA EDTA GicNAc KPLC IPTG Kamr kb k D a l LB LPS MurNAc M u r N A c - p e n t a p e p t i d e MW NA LIST OF ABBREVIATIONS a m p i c i 1 1 i n - r e s i s t a n t c h l o r a m p h e n i c o l - r e s i s t a n t c o l o n y - f o r m i n g u n i t E. c o l i G e n e t i c S t o c k C e n t e r , Y a l e U n i v e r s i t y C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y D - a l a n i n e m e s o - d i a m i n o p i m e l i c a c i d D - g l u t a m i c a c i d D a v i s m i n i m a l a g a r e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d N - a c e t y l g l u c o s a m i n e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y i s o p r o p y l J 3 - D - t h i o g a l a t o s i d e k a n a m y c i n - r e s i s t a n t k i l o b a s e p a i r s k i l o d a l t o n L u r i a b r o t h l i p o p c . / s a c c h a r i d e N - a c e t y l m u r a m i c a c i d N - a c e t y l m u r a m y l - L - a l a n y l - D - g l u t a m y l - m e s o - D A P - D - a l a n y l - D - a l a n i n e m o l e c u l a r w e i g h t n u t r i e n t a g a r

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PBP p e n i c i l l i n b i n d i n g p r o t e i n PG p e p t i d o g l y c a n ppGpp g u a n o s i n e ' 5 ' - d i p h o s p h a t e 3 ' - d i p h o s p h a t e pp pG pp g u a n o s i n e 5 ' - t r i p h o s p h a t e 3 ' - d i p h o s p h a t e SDS s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e SDS-PAGE SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s TCA t r i c h l o r o a c e t i c a c i d T e t r t e t r a c y c l i n e - r e s i s t a n t t s t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e TSA t r y p t i c s o y a g a r TSB t r y p t i c s o y b r o t h T r i s t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e UDP u r i d i n e 5 ' - d i p h o s p h a t e X - g a l 5 b r o m o 4 c h l o r o 3 i n d o l y l A D -g a l a c t o p y r a n o s i d e

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ACKNOWLEDGEMENTS xvi I w o u l d l i k e t o t h a n k my s u p e r v i s o r D r . E . E . I s h i g u r o f o r h i s h e l p , g u i d a n c e , s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t d u r i n g t h i s s t u d y . I am v e r y g r a t e f u l f o r t h e h e l p a n d f r i e n d s h i p o f D r . I s h i g u r o ' s f a m i l y . I t h a n k a l l m em b er s o f o u r d e p a r t m e n t f o r t h e i r h e l p a n d a d v i c e . S p e c i a l t h a n k s go t o W. K u s s e r , K-H. M u e l l e r , a n d J . S . Tao f o r t h e i r s t i m u l a t i n g d i s c u s s i o n s . T h a n k s t o my w i f e , Z h e n m i n g Hu a n d my p a r e n t s f o r t h e i r l o v e , e n c o u r a g e m e n t a n d s u p p o r t d u r i n g a l l t h o s e y e a r s , w i t h o u t a l l t h e s e , i t i s i m p o s s i b l e f o r me t o f i n i s h t h i s t h e s i s . F i n a n c i a l s u p p o r t w as p r o v i d e d h y a U n i v e r s i t y o f V i c t o r i a G r a d u a t e F e l l o w s h i p a n d b y a g r a n t t o D r . E . E . I s h i g u r o f r o m t h e N a t u r a l S c i e n c e s a n d R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a .

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INTRODUCTION I . T h e C e l l W a l l o f E s c h e r i c h i a c o l i L i k e o t h e r G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a , E s c h e r i c h i a c o l i p o s s e s s e s a c e l l w a l l c o m p o s e d o f t w o l a y e r s . Th e e x t e r n a l l a y e r , o r o u t e r m e m b r a n e , i s a p p r o x i m a t e l y 7 . 5 nm t h i c k a n d i s c o m p o s e d o f p h o s p h o l i p i d s , l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) , a n d a s e t o f c h a r a c t e r i s t i c p r o t e i n s ( 1 ) . U n d e r l y i n g t h e o u t e r m e m b ra n e i s a l a y e r c o m p o s e d o f t h e p o l y m e r known a s p e p t i d o g l y c a n ( P G) . Th e o u t e r m e m b r a n e i s s t r u c t u r a l l y a n a s y m m e t r i c b i l a y e r i n w h i c h t h e p h o s p h o l i p i d s o c c u r e x c l u s i v e l y i n t h e i n n e r l e a f l e t o f t h e m e m b r a n e , a n d t h e o u t e r l e a f l e t c o n t a i n s t h e h y d r o p h o b i c l i p i d A p o r t i o n o f LPS. LPS i s a u n i q u e c o m p o n e n t o f t h e o u t e r m e m b ra n e w h i c h c o n s i s t s o f t h r e e p a r t s : ( i ) t h e l i p i d A p o r t i o n w h i c h a n c h o r s LPS t o t h e o u t e r m e m b r a n e ; ( i i ) t h e c o r e p o l y s a c c h r i d e r e g i o n w h i c h i s l i n k e d t o l i p i d A; a n d ( i i i ) t h e h y d r o p h i l i c 0 p o l y s a c c h a r i d e r e g i o n w h i c h i s l i n k e d t o t h e c o r e ( 2 ) . T h e o u t e r m e m b ra n e r e p r e s e n t s a s e l e c t i v e p e r m e a b i l i t y b a r r i e r . S e v e r a l o u t e r m e m b ra n e p r o t e i n s , known a s p o r i n s , f o r m t r a n s m e m b r a n e c h a n n e l s w h i c h s e r v e a s s i z i n g f i l t e r s w h i c h p e r m i t p a s s a g e o f c e r t a i n h y d r o p h i l i c s u b s t a n c e s i n t o t h e c e l l . T h i s s t r u c t u r a l f e a t u r e r e s t r i c t s e n t r y o f

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many t o x i c s u b s t a n c e s s u c h a s c e r t a i n a n t i b i o t i c s , d e t e r g e n t s , a n d PG d i g e s t i v e e n z y m e s ( 3 ) . PG l i p o p r o t e i n i s o n e o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n w h i c h i s n o t d i r e c t l y i n v o l v e d i n b a r r i e r f u n c t i o n . PG l i p o p r o t e i n i s a n a b u n d a n t p r o t e i n ( a b o u t 7 x 10 5 c o p i e s p e r c e l l ) i n v o l v e d i n a c r u c i a l s t r u c t u r a l f u n c  t i o n . An N - t e r m i n a l c y s t e i n e r e s i d u e o f t h e l i p o p r o t e i n i s s u b s t i t u t e d w i t h a f a t t y a c i d r e s i d u e w h i c h i s e m b e d d e d i n t h e l i p i d b i l a y e r o f t h e o u t e r m em b ra n e ( 4 ) . A b o u t o n e - t h i r d o f t h e PG l i p o p r o t e i n m o l e c u l e s i s c o v a l e n t l y b o u n d t o t h e PG l a y e r w h i c h u n d e r l i e s t h e o u t e r m e m b r a n e , a n d t h e r e m a i n d e r o c c u r i n t h e f r e e f o r m . D e l e t i o n m u t a n t s c o m p l e t e l y l a c k i n g PG l i p o p r o t e i n a r e v i a b l e b u t t h e i r c e l l e n v e l o p e s a r e a p p a r e n t l y u n s t a b l e ( 5 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e p h y s i c a l b r i d g e f o r m e d b e t w e e n t h e o u t e r m e m b ra n e e n d PG, b y PG l i p o p r o t e i n , may b e i m p o r t a n t i n m a i n t a i n i n g t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f t h e w a l l . I n t h i s r e g a r d , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t o t h e r o u t e r m e m b ra n e p r o t e i n s , s u c h a s t h e OmpA p r o t e i n a n d t h e p o r i n s OmpC a n d QrnpF, a r e a l s o i n v o l v e d i n s t a b i l i z i n g t h e w a l l t h r o u g h n o n c o v a l e n t i n t e r a c t i o n s w i t h PG ( 6 ) . PG i s a p o r o u s n e t - l i k e m a c r o m o l e c u l e w h i c h c o m p l e t e l y e n c l o s e s t h e u n d e r l y i n g c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . I t s e r v e s a n e s s e n t i a l f u n c t i o n b y p r o v i d i n g t h e m e m b ra n e w i t h m e c h a n i c a l s u p p o r t , w i t h o u t w h i c h t h e m em br a ne w o u l d u n d e r g o o s m o t i c a l l y i n d u c e d r u p t u r e ( 7 ) . PG i s u s u a l l y i s o l a t e d b y s o l u b i l i z i n g t h e m e m b r a n e s w i t h b o i l i n g s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) , v a r i o u s w a s h i n g s t e p s , a n d p r o t e a s e d i g e s t i o n t o r e m o v e t h e

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s e m i r i g i d m a c r o m o l e c u l e w h i c h i s r e s p o n s i b l e f o r d e t e r m i n i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c r o d - s h a p e d m o r p h o l o g y o f E. c o l i ( 8 ) . As a l r e a d y n o t e d , t h e PG l a y e r i s a s s o c i a t e d w i t h t h e o u t e r m e m b ra n e t h r o u g h c o v a l e n t a s w e l l n o n c o l v a l e n t i n t e r a c t i o n s . On t h e o t h e r h a n d , t h e r e i s no d i r e c t e v i d e n c e f o r p h y s i c a l c o n t a c t s b e t w e e n PG a n d t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . H o w e v e r , u l t r a s t r u c t u r a l s t u d i e s s u g g e s t t h e o c c u r r e n c e o f " a d h e s i o n s i t e s " w h i c h a r e p r o p o s e d t o r e p r e s e n t a r e a s w h e r e t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e , o u t e r m e m b r a n e , a n d PG a d h e r e t o e a c h o t h e r ( 9 ) . T h e s e a d h e s i o n s i t e s may b e r e g i o n s w h e r e t h e o u t e r a n d c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s a r e f u s e d b u t , e v e n s o , i t i s u n c l e a r w h a t t h e s t a t e o f PG i s i n t h e s e a r e a s . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e s e a r e t h e s i t e s w h e r e t h e o u t e r m e m b r a n e c o m p o n e n t s , s u c h a s LPS a n d o u t e r m e m b ra n e p r o t e i n s , a r e s y n t h e s i z e d a n d e x p o r t e d a n d w h e r e t h e n e w l y s y n t h e s i z e d PG c h a i n s a r e i n s e r t e d i n t o t h e e x i s t i n g c e l l w a l l PG. I t h a s b e e n f u r t h e r s u g g e s t e d t h a t t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e o u t e r m e m b r a n e , c y t o p l a s m i c m e m b r a n e , a n d PG i n t h e a d h e s i o n r e g i o n s may b e e s s e n t i a l f o r m a i n t a i n i n g c e l l e n v e l o p e i n t e g r i t y a n d f o r c o o r d i n a t e l y r e g u l a t i n g c e l l e n v e l o p e e x p a n s i o n a n d d i v i s i o n d u r i n g t h e c e l l c y c l e ( 1 0 ) . I I . E. c o l i P e p t i d o g l y c a n S t r u c t u r e 1 . G e n e r a l S t r u c t u r a l F e a t u r e s

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F i g . 1 i l l u s t r a t e s t h e g e n e r a l f e a t u r e s o f E. c o l i PG. I t s h o u l d b e n o t e d , h o w e v e r , t h a t t h i s i l l u s t r a t i o n i s a l m o s t s u r e l y o v e r s i m p l i f i e d i n v i e w o f t h e r e c e n t o b s e r v a t i o n s d i s c u s s e d b e l o w . PG i s c o m p o s e d o f l o n g g l y c a n c h a i n s i n t e r l i n k e d b y s h o r t p e p t i d e s u b s t i t u t i o n s ( 1 1 ) . Th e g l y c a n m o i e t y c o n s i s t s o f l i n e a r s t r a n d s o f a l t e r n a t i n g r e s i d u e s o f N - a c e t y l g l u c o s a m i n e (GlcNAc) a n d N - a c e t y l m u r a m i c a c i d (MurNAc). I n E. c o l i , e a c h g l y c a n c h a i n t e r m i n a t e s w i t h a n o n r e d u c i n g 1 , 6 - a n h y d r o MurNAc r e s i d u e . Th e a v e r a g e g l y c a n c h a i n l e n g t h , c a l c u l a t e d on t h e b a s i s o f t h e r a t i o o f 1 , 6 - a n h y d r o MurNAc t o t o t a l a m o u n t o f MurNAc, i s a b o u t 33 d i s a c c h a r i d e u n i t s l o n g , a n d t h i s i s e q u i v a l e n t t o a l e n g t h o f a p p r o x i m a t e l y 33 nm ( 1 2 ) . E a c h MurNAc r e s i d u e i s s u b s t i t u t e d w i t h a s h o r t p e p t i d e . The a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h i s p e p t i d e i s t y p i c a l l y L - a l a n y l - D - q l u t a m y l - m e s o - d i a m i n o p i m e l i c a c i d ( D A P ) - D - , ' l a n y l - D - a l a n i n e , g o i n g f r o m N - t e r m i n u s t o C - t e r m i n u s , b u t s h o r t e r d e r i v a t i v e s o f t h i s p e p t i d e a l s o o c c u r . T h u s , PG may b e v i e w e d a s a p o l y m e r c o m p o s e d o f a b a s i c r e p e a t i n g s u b u n i t r e p r e s e n t e d b y t h e d i s a c c h a r i d e - p e n t a p e p t i d e s h o w n i n F i g . 2 . I t i s a l s o w o r t h n o t i n g t h a t DAP a n d MurNAc o c c u r i n n a t u r e o n l y i n PG, a n d t h a t t h e o c c u r r e n c e o f D - a m i n o a c i d s i s u n i q u e t o PG a n d c e r t a i n o t h e r b a c t e r i a l c e l l w a l l p o l y m e r s s u c h a s t h e t e i c h o i c a c i d s ( 1 3 ) . T he i n d i v i d u a l p e p t i d o g l y c a n c h a i n s a r e l i n k e d t o n e i g h b o r i n g p e p t i d o g l y c a n c h a i n s t h r o u g h d i r e c t p e p t i d e b o n d s f o r m e d b e t w e e n a m i n o g r o u p o f DAP i n o n e p e p t i d e a n d t h e

(20)

*—1 M-J~H H-*~H M — H

H-/ H-/ H-/ H-/ H-/ H-/ H-/ H-/

c c c c c c c c *

1 / /

1 /

K m m h m m m m

/

A /

/ V

A /

/

G C C C C C C G

/

/ / / / / / /

-r-H — H K -m~ H

/

/ / / / / / /

G C C C C G G C

/

/ \ / / \ / A / /

M H I h' I H 1 H A A / A / A / A G G C C C C C C

a

L / / / / / / /

H - 3 - K H _ * ~ M H J - M H *

-/ -/ -/ -/ -/ -/ -/ -/ -/

c

,c

c

F i g . 1. G e n e r a l f e a t u r e s o f E. c o l i p e p t i d o g l y c a n . G, GlcN Ac; M, MurNAc. L i n e s c o n n e c t i n g G a n d M r e s i d u e s r e p r e s e n t g l y c o s i d i c b o n d s . — k , p e p t i d e f i d e c h a i n . _— 3— b e t w e e n t w o M r e s i d u e s r e p r e s e n t s c r o s s l i n k e d p e p t i d e s . M od el b u i l d i n g e x p e r i m e n t s i n d i c a t e t h a t c r o s s l i n k s c a n b e f o r m e d o n l y b e t w e e n e v e r y f o u r t h p e p t i d e s i d e c h a i n o n e a c h s i d e . M o d i f i e d f r o m " E s c h e r i c h i a c o l i a n d S a l m o n e l l a t y p n i m u r i u m . C e l l u l a r a n d m o l e c u l a r b i o l o g y " , ( N e i c S h a r d t , F . C . , e d . ) , p p . 2 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D. C.

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6 N - a e e t y l g l u c o s a m i n e N - a c e t y l m u r a m i c aci d O H H O H N H C = 0 C H. L a l a n i n e -D - g l u t a m i c a c i d C O CH I J / NH I HC—CH., I ° C = 0 I CH HC—(CH0 L - C O O H I 2 2 C = Q I NH N H 0 M p s o - d i a m i n o - pi lie a c i d D a l a n i n e -h c- ( c h 9 ) , - c- c o o h I 2 J H \ C = 0 ' N H l H C - C H I k C = 0 I D a l a n i n e -/ N H I \ H C - C H . I C O O H F i g . 2 . C h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e d i s a c c h a r i d e - p e n t a p e p t i d e u n i t ( t h e s o - c a l l e d m o n o m e r i c s u b u n i t ) p r e s e n t i n E. c o l i PG. M o d i f i e d f r o m " D e v e l o p m e n t a l b i o l o g y o f t h e b a c t e r i a " , ( D w o r k i n , M ., e d . ) , p p . 1 6 4 , M e n lo P a r k , C a l i f o r n i a , U . S . A .

(22)

c a r b o x y l g r o u p o f D - a l a n i n e i n a n a d j a c e n t p e p t i d e . T h i s f e a t u r e g i v e s PG t h e a p p e a r a n c e o f a n e t - l i k e s t r u c t u r e ( F i g . 1 ) . I n E. c o l i , a b o u t 50% o f t h e p e p t i d e s a r e c r o s s l i n k e d ( 1 4 ) . F u r t h e r m o r e , a b o u t 10% o f t h e p e p t i d e s a r e c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e o u t e r mem brane PG l i p o p r o t e i n t h r o u g h a l i n k a g e f o r m e d b e t w e e n t h e c a r b o x y l g r o u p o f DAP a n d t h e a m i n o g r o u p o f t h e C - t e r m i n a l l y s i n e o f l i p o p r o t e i n ( t h i s f e a t u r e i s n o t sho wn i n F i g . 1 ) . 2 . R e c e n t O b s e r v a t i o n s on t h e C h e m i c a l C o m p o s i t i o n o f PG Th e s t r u c t u r e o f PG, a s d e p i c t e d i n F i g . 1, w a s d e r i v e d p r i m a r i l y f r o m t h e c h a r a c t e r i z a t i o n a n d g u a n t i f i c a t i o n o f s o l u b l e f r a g m e n t s g e n e r a t e d f r o m PG b y e i t h e r c o n t r o l l e d p a r t i a l a c i d h y d r o l y s i s o r e n z y m a t i c d i g e s t i o n . I n t h e s e e a r l y s t u d i e s , t h e s o l u b l e d e r i v a t i v e s o f PG w e r e f r a c t i o n a t e d b y p a p e r o r t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , a n d a t o t a l o f e i g h t d i f f e r e n t d e r i v a t i v e s w e r e s e p a r a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d ( 1 5 ) . G l a u n e r a n d S c h w a r z ( 1 6 ) r e c e n t l y u s e d h i g h p e r f o r m a n c e l i g u i d c h r o m a t o g r a p h y (HPLC) t o s e p a r a t e s o l u b l e PG f r a g m e n t s g e n e r a t e d b y f i - N - a c e t y l m u r a m i d a s e d i g e s t i o n . T h e y i d e n t i f i e d a t l e a s t e i g h t y d i f f e r e n t PG d e r i v a t i v e s . T h e i r r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e s t r u c t u r e o f E. c o l i PG w as f a r m o r e c o m p l e x t h a n p r e v i o u s l y r e a l i z e d . T h e i r m a i n f i n d i n g s a r e a s f o l l o w s . ( i ) T h e y d i s c o v e r e d p e p t i d e s w h i c h t e r m i n a t e d w i t h g l y c i n e r a t h e r t h a n D - a l a n i n e . ( i i ) A n o v e l t y p e o f p e p t i d e c r o s s - l i n k a g e b e t w e e n tw o DAP r e i d u e s w a s i d e n t i f i e d , ( i i i )

(23)

I n a d d i t i o n t o t h e p r e v i o u s l y known c l a s s e s o f s o - c a l l e d m o n o m e r i c s u b u n i t s ( d i s a c c h a r i d e - p e p t i d e s , o n e o f w h i c h i s s ho w n i n F i g . 2) a n d d i m e r i c s u b u n i t s ( t w o d i s a c c h a r i d e - p e p t i d e u n i t s j o i n e d b y p e p t i d e c r o s s - l i n k a g e s ) , t w o new g r o u p s o f d e r i v a t i v e s c o n s i s t i n g o f t r i m e r i c a n d t e t r a m e r i c d i s a c c h a r i d e - p e p t i d e s u b u n i t s w e r e d i s c o v e r e d , ( i v ) F i n a l l y , t h e s e new t y p e s o f s u b u n i t s c a r r y i n g n o v e l p e p t i d e s u b s t i t u t i o n s w e r e l i n k e d t o e a c h o t h e r i n a l l p o s s i b l e c o m b i n a t i o n s , a n d i t i s t h i s f a c t t h a t was p r i m a r i l y r e s p o n s i b l e f o r t h e new f o u n d c o m p l e x i t y i n E. c o l i PG s t r u c t u r e . I t i s u n d o u b t e d l y t o o e a r l y t o f u l l y a p p r e c i a t e t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e f i n d i n g s o f G l a u n e r a n d S c h w a r z ( 1 2 ) . N e v e r t h e l e s s , e v i d e n c e h a s a l r e a d y s t a r t e d t o a c c u m u l a t e w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e n o v e l t y p e s o f PG s u g a r - p e p t i d e s t h e y d i s c o v e r e d may p l a y s t r u c t u r a l o r r e g u l a t o r y r o l e s i n E. c o l i PG m e t a b o l i s m . W h i l e i t may n o t b e i m m e d i a t e l / p o s s i b l e t o e v a l u a t e many o f t h e s e f i n d i n g s , a s h o r t s u mm ar y w i l l b e p r e s e n t e d h e r e . One s i g n i f i c a n t o b s e r v a t i o n i s t h a t t h e s t r u c t u r e o f n e w l y s y n t h e s i z e d PG d i f f e r s f r o m t h a t c f o l d e r o r m a t u r e PG i n s e v e r a l r e s p e c t s ( 1 7 ) . ( i ) N ew ly s y n t h e s i z e d PG i s l e s s c r o s s - l i n k e d . ( i i ) Newly s y n t h e s i z e d PG c o n t a i n s l e s s c o v a l e n t l y b o u n d ’ i p o p r o t e i n . ( H i ) T h e c l a s s o f s u b u n i t s c a r r y i n g p e n t a p e p t i d e s u b s t i t u t i o n s i s f o u n d i n h i g h e r a m o u n t s i n n e w l y s y n t h e s i z e d . PG. S e v e r a l r e p o r t s i n d i c a t e t h a t t h e c o m p o s i t i o n o f E. c o l i PG i s i n f l u e n c e d b y g r o w t h c o n d i t i o n s ( 1 2 , 18, 1 9 ) . T h e a m o u n t o f p e p t i d e s

(24)

l y a f f e c t e d b y c h a n g e s i n g r o w t h c o n d i t i o n s . F o r e x a m p l e , t h e p r o p o r t i o n o f g l y c i n e - c o n t a i n i n g p e p t i d e s i s l o w e r i n c e l l s g r o w n i n m i n i m a l medium w i t h o u t g l y c i n e a s c o m p a r e d t o c e l l s g r o w n i n c o m p l e x medium a n d h a s b e e n f o u n d t o d o u b l e i n a m o u n t when c e l l s e n t e r s t a t i o n a r y p h a s e ( 1 2 ) . W i t h r e s p e c t t o p e p t i d e s i n v o l v e d i n DAP-DAP c r o s s - l i n k a g e , a a a r k e d i n c r e a s e was o b s e r v e d i n s t a t i o n a r y p h a s e c e l l s a n d i n c e l l s g r o w n a t h i g h t e m p e r a t u r e ( 1 8 ) . I n a n o t h e r r e p o r t , t h e s t r u c t u r a l c o m p o s i t i o n o f PG was shown t o u n d e r g o c h a n g e s a s a c o n s e q u e n c e o1 a m i n o a c i d d e p r i v a t i o n , a n d i t was s u g g e s t e d t h a t t h i s a l t e r a t i o n i n PG s t r u c t u r e c o n t r i b u t e d , a t l e a s t i n p a r t , t o t h e m e c h a n i s m o f p h e n o t y p i c t o l e r a i c e , a p h e n o m e n o n i n v . h i c h a m i n o a c i d - d e p r i v e d E. c o l i d e v e l o p s r e s i s t a n c e t o a u t o l y s i s i n d u c e d b y i n h i b i t o r s o f PG s y n t h e s i s s u c h a s fl- l a c t a m a n t i b i o t i c s ( 1 9 ) . T h i s m a t t e r i s d e s c r i b e d i n more d e t a i l i n a l a t e r s e c t i o n . I n su m m ar y , r e c e n t s t r u c t u r a l s t u d i e s i n d i c a t e t h a t E. c o l l PG i s m o re c o m p l e x t h a n shown i n F i g . 1. F u r t h e r m o r e , i t a p p e a r s t h a t some o f t h e s e n e w l y r e c o g n i z e d s t r u c t u r a l f e a t u r e s may d e p e n d on g r o w t h c o n d i t i o n s . An u p d a t e d m o de l b a s e d o n t h e s e new d a t a h a s b e e n i n i t i a t e d b u t i s f a r f r o m c o m p l e t e . E a r l i e r m o d e l s f a v o r e d a c e l l w a l l c o m p o s e d o f a s i n g l e c o n t i n u o u s l a y e r o f PG a r r a n g e d much l i k e t h a t sh ow n i n F i g . 1. I n t h i s l a y e r , t h e p o l y s a c c h a r i d e c h a i n s a r e p r o p o s e d t o r u n p a r a l l e l t o e a c h o t h e r i n a f l a t p l a n e w i t h t h e p e p t i d e

(25)

10 s i d e c h a i n s p o i n t i n g i n o n e d i r e c t i o n ( 2 0 ) . H o w e v e r , t h i s s i m p l e m o n o l a y e r m o d e l h a s b e e n s e r i o u s l y c h a l l e n g e d b y t h e s t r u c t u r a l s t u d i e s o f G l a u n e r a n d S c h w a r z ( 1 2 ) , a n d a n y a t t e m p t a t m o d e l i n g m u s t now t a k e i n t o c o n s i d e r a t i o n t h e p o s s i b i l i t y o f a m u l t i l a y e r e d PG i n E. c o l i . S c h w a r z ( 2 1 ) h a s p r o p o s e d t h a t t h e c e l l w a l l PG o f c o l i i s c o m p o s e d o f m u l t i l a y e r e d PG s h e e t s . H i s p r o p o s a l i s b a s e d on t h e f o l l o w i n g o b s e r v a t i o n s : ( i ) M u r a m i d a s e d i g e s t i o n o f PG r e l e a s e d f r a g m e n t s w h i c h w e r e c r o s s l i n k e d m u l t i m e r s ( c r i m e r s a n d t e t r a m e r s ) o f t h e b a s i c PG r e p e a t i n g s u b u n i t ( F i g . 2 ) . The e x i s t e n c e o f s u c h s t r u c t u r a l c o m p o n e n t s c o u l d n o t b e a c c o u n t e d f o r b y a m o n o l a y e r e d PG. F o r e x a m p l e , t h e t r i m e r i c u n i t s w o u l d b e i n v o l v e d i n l i n k i n g t h r e e s e p a r a t e PG s t r a n d s t o g e t h e r , a n d t h i s c o u l d b e p o s s i b l e o n l y i f t h e t r i m e r s w e r e l o c a t e d a t t h e e n d s o f PG s t r a n d s i f t h e PG wa s a r r a n g e d a s a m o n o l a y e r . H o w e v e r , a b o u t 80% o f t h e t r i m e r s w e r e sh own t o b e d e r i v e d f r o m w i t h i n t h e g l y c a n s t r a n d s ( 1 2 ) , s u g g e s t i n g t h a t a t l e a s t c u e o f t h e t h r e e g l y c a n c h a i n s m u s t l i e o u t s i d e t h e p l a n e o f t h e o t h e r t w o g l y c a n s t r a n d s a s sh o w n i n F i g . 3A. ( i i ) P u l s e - c h a s e e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a t t h e c r o s s l i n k a g e s i n PG h a d d i f f e r e n t l i f e t i m e s , i . e . , t h e c r o s s l i n k a g e s f o r m e d b e t w e e n n e w l y s y n t h e s i z e d PG s t r a n a s w e r e r e l a t i v e l y s t a b l e b u t t h o s e c r o s s l i n k a g e s f o r m e d b e t w e e n n e w l y i n s e r t e d a n d p r e e x i s t i n g PG s t r a n d s w e r e u n s t a b l e ( 1 2 ) . One p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e r e s u l t s i s a m u l t i l a y e r e d PG g r o w i n g a c c o r d i n g t o t h e " i n s i d e - t o - o u t s i d e " m e c h a n i s m sh o wn

(26)

(A)

(B)

F i g . 3 . M o de l o f t h e m u l t i l a y e r e d PG o f E. c o l i . (A) T h e s t r u c t u r e o f t h e t r i m e r i c s u b u n i t d e r i v e d f r o m t h e c r o s s l i n k i n g o f 3 i n d i v i d u a l PG s t r a n d s w h i c h r e s i d e :i.n d i f f e r e n t p l a n e s . The a r r o w h e a d s i n d i c a t e t h e d o n o r s i t e s a n d t h e s p h e r e s i n d i c a t e t h e a c c e p t o r s i t e s o f t h e p e p t i d e s i d e c h a i n s . Th e i s o l a t i o n o f t h i s f r a g m e n t f r o m e n z y m a t i c a l l y d i g e s t e d PG g a v e r i s e t o t h e p r o p o s a l t h a t E. c o l i PG h a d t o b e m u l t i l a y e r e d r a t h e r m o n o l a y e r e d a s p r e v i o u s l y b e l i e v e d . (B) T h e m u l t i l a y e r e d s t r u c t u r e o f E. c o l i PG s h o w i n g s e c t i o n s o f 4 l a y e r s i n t e r c o n n e c t e d by p e p t i d e c r o s s l i n k a g e s . T h e c y l i n d r i c a l r o d s r e p r e s e n t t h e g l y c a n s t r a i n s , a n d t h e v e r t i c a l a n d h o r i z o n t a l l i n e s c o n n e c t e c t o t h e m r e p r e s e n t t h e c r o s s i i n k e d p e p t i d e s i d e c h a i n s . M o d i f i e d f r o m r e f . 2 1 .

(27)

i n F i g . 3B ( 2 1 ) . ( i i i ) R e c e n t e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f E. c o l i s p e c i m e n s p r e p a r e d b y t h e new, l e s s d i s r u p t i v e m e t h o d s ( p r o g r e s s i v e l o w e r i n g o f t e m p e r a t u r e i n e m b e d d i n g a n d f r e e z e - s u b s t i t u t i o n ) d e v e l o p e d b y K o b o t a n d K e l l e n b e r g e r ( 2 2 ) , r e v e a l e d PG a s a t h i c k g e l - l i k e s t r u c t u r e , a p p r o x i m a t e l y 10 nm w i d e , w i t h a h i g h w a t e r c o n t e n t . The e s t i m a t e d t h i c k n e s s o f PG (1 0 nm) i s e q u i v a l e n t t o t h e t h i c k n e s s o f t h e p e r i p l a s m i c s p a c e . H o b o t a n d K e l l e n b e r g e r h a v e t h e r e f o r e p r o p o s e d t h a t t h e p e r i p l a s m i c s p a c e i s f i l l e d w i t h a s o c a l l e d " p e r i p l a s m i c g e l " w h i c h i s b e l i e v e d t o b e m a i n l y c o m p o s e d o f PG, p e r i p l a s m i c p r o t e i n s a n d p o l y ; ^ c c h a r i d e s . T h i s g e l - l i k e PG i s f u r t h e r p r o p o s e d t o b e c o m p o s e d o f s e v e r a l l a y e r s o f h i g h l y h y d r a t e d PG. The d e g r e e o f c r o s s l i n k i n g b e t w e e n p e p t i d e s i d e c h a i n s i s t h o u g h t t o b e t n e h i g h e s t i n t h e l a y e r i m m e d i a t e l y a d j a c e n t t o t h e o u t e r m e m b r a n e , a n d t h e d e g r e e o f c r o s s l i n k a g e t h e n d e c r e a s e s p r o g r e s s i v e l y i n t h e u n d e r l y i n g l a y e r s w i t h t h e l o w e s t a m o u n t f o u n d i n t h e l a y e r a d j a c e n t t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . The c o n c e p t o f a g e l - l i k e PG i s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e f i n d i n g t h a t t h e r a t e o f l a t e r a l d i f f u s i o n o f a p e r i p l a s m i c p r o t e i n i n t h e p e i i p l a s m i c s p a c e i s a b o u t 1 0 0 0 - f o l d l o w e r t h a n t h a t i n f r e e a q u e o u s e n v i r o n m e n t ( 2 3 ) . On t h e o t h e r h a n d , c o m p o n e n t s o t h e r t h a n PG m u s t s u r e l y c o n t r i b u t e t o t h e v i s c o s i t y , a n d t h e d e g r e e o f c o n t r i b u t i o n made b y PG i s u n k n o w n . ( i v ) A c c o r d i n g t o t h e c a l c u l a t i o n b y S c h w a r z ( 2 1 ) , t h e a v e r a g e a m o u n t o f PG f o u n d ir* a n E. c o l i c e l l w o u l d b e s u f f i c i e n t t o f o r m t h r e e l a y e r s . F ro m t h e s t r u c t u r a l

(28)

s t a n d p o i n t , t h r e e l a y e r s o f PG may b e t h e minimum n u m b e r n e c e s s a r y t o g u a r a n t e e t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f a n E. c o l i c e l l . 3 . T h r e e D i m e n s i o n a l S t r u c t u r e o f PG The t h r e e d i m e n s i o n a l a r r a n g e m e n t o f PG i s s t i l l u n c e r t a i n . B a r n i c k e l e t a l . ( 24) h a v e r e c e n t l y p r o p o s e d a m o d e l f o r PG b a s e d o n c o m p u t e r a i d e d c a l c u l a t i o n s o f t h e m o s t e n e r g e t i c a l l y f a v o r a b l e c o n f o r m a t i o n s a s s u m e d b y t h e g l y c a n a n d p e p t i d e c h a i n s . I n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s m o d e l s , t h e y s u g g e s t e d t h a t t h e g l y c a n c h a i n s r u n p a r a l l e l t o e a c h o t h e r . B a s e d on o t h e r s t u d i e s ( 2 5 ) , t h e s e g l y c a n c h a i n s a r e p r o p o s e d t o r u n a r o u n d t h e c i r c u m f e r e n c e o f t h e c e l l c y l i n d e r , i . e . , p e r p e n d i c u l a r t o t h e l o n g a x i s o f t h e r o d - s h a p e d E. c o l i c e l l . S i n c e t h e a v e r a g e l e n g t h o f a g l y c a n s t r a n d i s a b o u t 33 nm (3 3 d i s a c c h a r i d e - p e p t i d e s u b u n i t s ) , a n e s t i m a t e d 80 s t r a n d s s t a c k e d e n d t o e n d w o u l d t h e r e f o r e b e n e e d e d t o c o v e r t h e c i r c u m f e r e n c e o n c e . I n s t e a d o f f o r m i n g a f l a t p l a n e , B a r n i c k e l e t a l . ( 2 4 ) p r o p o s e d t h a t t h e s u g a r r i n g s a r e t i l t e d w i t h r e s p e c t t o e a c h o t h e r i n s u c h a way t h a t e a c h PG s t r a n d a c t u a l l y e x i s t s i n a h e l i c a l c o n f o r m a t i o n . The p e p t i d e s c o n s e q u e n t l y c a n n o t a l l p r o t r u d e i n t h e same d i r e c t i o n f r o m t h e p l a n e f o r m e d b y t h e g l y c a n s t r a n d s . I n s t e a d , e a c h p e p t i d e s i d e c h a i n i s p r o p o s e d t o b e o r i e n t e d a b o u t 90 d e g r e e s a r o u n d t h e h e l i c a l g l y c a n r e l a t i v e t o i t s n e i g h b o r i n g p e p t i d e s i d e c h a i n s . As a r e s u l t , o n l y o n e o f e v e r y f o u r p e p t i d e s i d e

(29)

14 c h a i n s i s p o s i t i o n e d p r o p e r l y s o t h a t i t c a n b e c r o s s l i n k e d t o a p e p t i d e i n t h e s a m e p l a n e o n a n e i g h b o r i n g s t r a n d . T h e p r o p o s e d m u l t i l a y e r e d a r r a n g e m e n t f o r PG c o u l d b e r e a d i l y a c c o u n t e d f o r b y t h i s m o d e l . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e g l y c a n s t r a n d s c o u l d a d o p t a v a r i e t y o f c o n f o r m a t i o n s b a s e d o n d i f f e r e n t d e g r e e s o f t w i s t i n g b e t w e e n n e i g h b o r i n g s u g a r r e s i d u e s . T h i s may e x p l a i n how t h e c e l l w a l l PG c a n b e b o t h r i g i d i n s om e a r e a s a n d f l e x i b l e i n o t h e r a r e a s i n o r d e r t o f u l f i l l i t s b i o l o g i c a l f u n c t i o n a s a s t r e s s - b e a r i n g f a b r i c . T h e g l y c a n c h a i n s a n d t h e c r o s s l i n k e d p e p t i d e s i d e c h a i n s a r e t h o u g h t t o p r o v i d e FG w i t h t h e r i g i d i t y n e c e s s a r y t o p r o t e c t t h e c e l l f r o m o s m o t i c p r e s s u r e , w h i l e t h e p r o p o s e d d i f f e r e n t s t a t e s o f t w i s t i n g b e t w e e n t h e s u g a r r e s i d u e s p r o v i d e f o r a c e r t a i n d e g r e e o f f l e x i b i l i t y t o a l l o w t h e c e l l t o u n d e r g o t h e s w e l l i n g o r s h r i n k i n g w h i c h h a v e b e e n o b s e r v e d t o o c c u i i n r e s p o n s e t o e n v i r o n m e n t a l c h a n g e s ( 2 6 ) . I I I . PG B i o s y n t h e s i s 1. B i o s y n t h e t i c P a t h w a y o f PG Some o f t h e m a i n s t e p s i n PG b i o s y n t h e s i s i n E. c o l i a r e s u m m a r i z e d i n F i g . 4 . Th e PG b i o s y n t h e t i c p a t h w a y may b e d i v i d e d i n t o t h r e e s t a g e s , e a c h o f w h i c h t a k e s p l a c e i n a d i f f e r e n t c e l l u l a r c o m p a r t m e n t ( 1 7 , 2 7 ) . I n t h e f i r s t s t a g e , t h e U D P - a c t i v a t e d p r e c u r s o r s , UDP-N- a c e t y l g l u c o s a m i n e (UD?GlcNAc) a n d U D P N a c e t y l m u r a m y l L A l a

(30)

- UDP-NADP NADPH Pi P h o s p h o e n o lp y r u v a t e U D P - M u r N A c - ^ — UDP-GlcNAc --- UDP-GlcNAc ^ L - M a 2 e n o l p y r u v a t e 1 UMP ATP UDP-MurNAc-L-Ala ^ D - G l u ATP UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-meso-DAP-D-Ala-D-Ala' (UDP-M urNAc-pentapeplide) UDP-MurHAc-L-Ala-D-Glu m e s o - D A P ♦ \ T P U D P - M u r N A c - L - A l a - D - G l u - m e s o - D A P ATP L - A l a --- »- D - A l a --- ► D - A l a - D - A l a 6 7 GCL-P-P-MurNAc-pentapeptide Cell Vail Acceptor GCL-P-P-M urNAc-pentapeptide V Cell Vail Acceptor Plus M urN A c-pentapeptide I GlcNAc GCL-P-P GCL-P f 12

(31)

16 F i g . 4 . Th e m a i n s t e p s i n p e p t i d o g l y c a n b i o s y n t h e s i s i n E . c o l i . T h e e n z y m e s c a t a l y z i n g t h e i n d i c a t e d r e a c t i o n s a r e : 1, p h o s p h o e n o l - p y r u v a t e : U D P - G l c N A c - p y r o p h o s p h o r y l a s e ; 2 , UDP- G l c N A c - e n o l p y r u v a t e r e d u c t a s e ; 3 , L - a l a n i n e a d d i n g e n z y m e ; 4 , D - g l u t a m a t e a d d i n g e n z y m e ; 5 , m e s o -DAP a d d i n g e n z y m e ; 6 , a l a n i n e r a c e m a s e ; 7 , D - a l a n y l - D - a l a n i n e s y n t h e t a s e ; 8 , D- a l a n y l - D - a l a n i n e a d d i n g e n z y m e ; 9 , U D P - M u r N A c - p e n t a p e p t i d e t r a n s l o c a s e ; 1 0 , UDP-GlcNAc t r a n s l o c a s e ; 1 1 , PG t r a n s g l y c o - s y l a s e a n d / o r t r a n s p e p t i d a s e ( P B P s ) ; 1 2 , u n d e c a p r e n o l p y r o p h o s p h a t e p y r o p h o s p h a t a s e . M o d i f i e d , w i t h h i s p e r m i s s i o n , f r o m J . S . T a o ' s M. S c . t h e s i s , U n i v e r s i t y o f V i c t o r i a ( 1 9 9 0 ) .

(32)

s y n t h e s i z e d b y a s e t o f s o l u b l e e n z y m e s . T h e i n d i v i d u a l s t e p s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f UDP-GlcNAc h a v e n o t b e e n s t u d i e d i n E. c o l i a n d a r e n o t sh own i n F i g . 4 . UDP-GlcNAc i s n o t o n l y t h e p r e c u r s o r f o r t h e s y n t h e s i s o f UDP-MurNAc ( r e a c t i o n s 1, 2 ) b u t a l s o s e r v e s a s a p r e c u r s o r f o r t h e s y n t h e s i s o f LPS, a n o t h e r m a j o r c o m p o n e n t o f c e l l e n v e l o p e o f E. c o l i ( 2 8 ) . U D P - M u r N A c - p e n t a p e p t i d e i s f o r m e d b y s e q u e n t i a l a d d i t i o n o f L - A l a , D - G l u , m e s o -DAP, a n d D - A l a - D - A l a t o UDP-MurNAc i n a s e r i e s o f A T P - d e p e n d e n t r e a c t i o n s c a t a l y z e d b y s p e c i f i c a m i n o a c i d l i g a s e s ( r e a c t i o n s 3 - 8 ) . The s e c o n d s t a g e i n v o l v e s t h e s e q u e n t i a l t r a n s l o c a t i o n o f P - M u r N A c - p e n t a p e p t i d e a n d GlcNAc f r o m t h e U D P - a c t i v a t e d p r e c u r s o r s t o a m e m b r a n e g l y c o s y l c a r r i e r l i p i d (GCL-P) b y t w o m e m b r a n e - b o u n d e n z y m e s ( 2 9 , 30) t o y i e l d t h e l i p i d - i n t e r m e d i - a t e s , G C L - P - P - M u r N A C - p e n t a p e p t i d e a n d G C L - P -P - M u r N A c- ( G l c N A c ) - p e n t a p e p t i d e ( r e a c t i o n s 9 , 1 0 ) . T h e l i p i d c a r r i e r h a s b e e n i d e n t i f i e d a s u n d e c a p r e n y l p h o s p h a t e , a m i n o r m e m b r a n e l i p i d . U n d e c a p r e n y l p h o s p h a t e i s a l s o i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f o t h e r h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e s s u c h a s LPS a n d c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e ( 3 1 ) . T h i s l i p i d c a r r i e r s e r v e s a s m e a n s o f t r a n s p o r t i n g h y d r o p h i l i c g l y c a n s a c r o s s t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . S i n c e t h e r e i s o n l y l i m i t e d a m o u n t o f t h i s l i p i d c a r r i e r i n t h e c e l l , i t s r e c y c l i n g ( r e a c t i o n 12) t u r n s o u t t o b e a k e y s t e p i n t h e s y n t h e s i s o f PG a n d o t h e r h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e s . T h u s , w h e n t h e s y n t h e s i s o f a n y o n e o f t h e s e

(33)

18 h e t e r o p o l y s a c c h r i d e s i s i n h i b i t e d , i t s p r e c u r s o r s a r e t r a p p e d o n t h e l i p i d c a r r i e r s , a n d t h i s e v e n t u a l l y l e a d s t o l i m i t e d a v a i l a b i l i t y o f t h e l i p i d c a r r i e r , w h i c h , i n t u r n , i n t e r f e r e s w i t h t h e s y n t h e s i s o f o t h e r h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e s ( 1 1 ) . T h e t h i r d s t a g e i n v o l v e s t h e t r a n s l o c a t i o n o f t h e d i s a c c h a r i d e - p e n t a p e p t i d e u n i t s f r o m t h e l i p i d c a r r i e r s t o a c c e p t o r s i t e s i n t h e g r o w i n g PG p o l y m e r ( r e a c t i o n 1 1 ) . T h i s r e a c t i o n i s a t t r i b u t e d t o a g r o u p o f c y t o p l a s m i c m e m b r a n e - b o u n d p e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n s ( P B P s ) , s o - c a l l e d b e c a u s e t h e y r e p r e s e n t t h e t a r g e t s f o r t h e f i - l a c t a m a n t i b i o t i c s ( 3 2 - 3 5 ) . T h e PBPs a r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e i r a b i l i t y t o c o v a l e n t l y a n d s p e c i f i c a l l y b i n d t o p e n i c i l l i n . B e c a u s e o f t h e i r f u n c t i o n a l c o m p l e x i t y , t h e r o l e s o f t h e PBPs i n PG m e t a b o l i s m , i n c l u d i n g PG p o l y m e r i z a t i o n , w i l l b e c o n s i d e r e d s e p a r a t e l y i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . 2 . The PBPs a n d T h e i r F u n c t i o n s i n PG M e t a b o l i s m At l e a s t 7 d i s t i n c t PBPs e x i s t i n E. c o l i , a n d t h e i r g e n e s h a v e b e e n m a p p e d , c l o n e d , a n d s e q u e n c e d ( 3 6 - 4 1 ) . Two a p p r o a c h e s h a v e b e e n u s e d t o d e t e r m i n e t h e f u n c t i o n s o f t h e PBPs ( 1 7 ) . F i r s t , m u t a n t s w i t h d e f e c t s i n t h e v a r i o u s PBPs h a v e b e e n i s o l a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d . S e c o n d , t h e s p e c i f i c i t y o f PBP b i n d i n g b y d i f f e r e n t f i - l a c t a m a n t i b i o t i c s h a s b e e n c o r r e l a t e d w i t h t h e e f f e c t s o f t h e s e a g e n t s o n c e l l u l a r m o r p h o l o g y a n d v i a b i l i t y . Th e s e v e n m a j o r PBPs a r e u s u a l l y s u b d i v i d e d i n t o t w o

(34)

g r o u p s a c c o r d i n g t o t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t b e c a u s e t h i s c o n v e n i e n t l y a l s o s u b d i v i d e s t h e m f u n c t i o n a l l y . T h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t P B P s , d e s i g n a t e d 1A, I B , 2 , a n d 3 , a r e d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e f i n a l s t a g e o f PG b i o s y n t h e s i s , i . e . , i n p o l y m e r i z a t i o n o f t h e PG s u b u n i t s . PBPs 1A, IB a n d 3 a r e b i f u n c t i o n a l e n z y m e s c a p a b l e o f c a t a l y z i n g t w o d i s t i n c t r e a c t i o n s , a t r a n s g l y c o s y l a t i o n r e a c t i o n t h a t r e s u l t s i n t h e e l o n g a t i o n o f a g l y c a n s t r a n d a n d a t r a n s p e p t i d a t i o n r e a c t i o n t h a t c r o s s l i n k s a d j a c e n t p e p t i d e s i d e c h a i n s ( 3 4 , 3 5 ) . As d i s c u s s e d f u r t h e r b e l o w , t h e t r a n s p e p t i d a s e a c t i v e s i t e s o f t h e s e e n z y m e s a r e t h e a c t u a l p e n i c i l l i n - b i n d i n g s i t e s , a n d p e n i c i l l i n h a s no e f f e c t o n t r a n s g l y c o s y l a t i o n ( 4 2 ) . F u r t h e r m o r e , t h e t r a n s g l y c o s y l a s e a c t i v i t i e s a r e s p e c i f i c a l l y i n h i b i t e d b y a n o t h e r a n t i b i o t i c , m o e n o m y c i n ( 4 2 , 4 3 ) . The p r e c i s e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e PBPs i n s e r t t h e d i s a c c h a r i d e - p e n t a p e p t i d e r e p e a t i n g u n i t s i n t o a g r o w i n g PG m o l e c u l e i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . T h e c r u c i a l q u e s t i o n o f w h a t r o l e s t h e t r a n s g l y c o s y l a s e a n d t r a n s p e p t i d a s e a c t i v i t i e s p l a y i n PG p o l y m e r i z a t i o n h a s n o t b e e n r e s o l v e d . H o w e v e r , i t i s known t h a t b o t h p e n i c i l l i n a n d m o e n o m y c i n i n h i b i t t h e i n c o r p o r a t i o n o f d i s a c c h a r i d e - p e n t a p e p t i d e u n i t s i n t o PG i n d i c a t i n g t h a t b o t h a c t i v i t i e s a r e n e c e s s a r y . S i n c e PG i s t h e d e t e r m i n a n t o f b a c t e r i a l c e l l s h a p e , E. c o l i c e l l w a l l PG may b e v i e w e d a s b e i n g c o m p o s e d o f c y l i n d e r s w h i c h a r e c l o s e d o f f a t t h e i r e n d s b y h e m i s p h e r i c a l c a p s . The h e m i s p h e r i c a l c a p s r e p r e s e n t t h e s e p t a l PG s y n t h e s i z e d d u r i n g

(35)

2 0 c e l l d i v i s i o n . G e n e t i c a n d p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s i n d i c a t e t h a t PBPs 1A a n d IB a r e p r i m a r i l y r e s p o n s i b l e f o r t h e p o l y m e r i z a t i o n o f c y l i n d r i c a l PG d u r i n g c e l l g r o w t h e l o n g a t i o n . T h u s , B - l a c t a m a n t i b i o t i c s w h i c h h a v e a h i g h a f f i n i t y f o r PBPs 1A a n d IB b l o c k c e l l e l o n g a t i o n . F u r t h e r m o r e , t h e PBP 1A a n d IB d o u b l e m u t a n t c a n n o t e l o n g a t e , a n d t h e c o m b i n a t i o n o f t h e t w o m u t a t i o n s i s c o n s e q u e n t l y l e t h a l ( 4 4 ) . On t h e o t h e r h a n d , m u t a n t s d e f e c t i v e i n e i t h e r PBP 1A o r IB a r e v i a b l e , s u g g e s t i n g t h a t PBP 1A a n d IB may s u b s t i t u t e f o r e a c h o t h e r ( 4 5 ) . F u r t h e r e v i d e n c e s u g g e s t s t h e i n v o l v e m e n t o f PBP 1 i n t h e s y n t h e s i s o f c y l i n d r i c a l PG. L o s s o f t h e PBP 2 f u n c t i o n e i t h e r t h r o u g h m u t a t i o n o r b y s p e c i f i c i n h i b i t i o n w i t h t h e f i - l a c t a m d e r i v a t i v e , m e c i l l i n a m , r e s u l t s i n t h e g r o w t h o f E. c o l i a s o s m o t i c a l l y s t a b l e s p h e r i c a l c e l l s w i t h i n c r e a s e d c e l l d i a m e t e r s r a t h e r t h e n o r m a l r o d - s h a p e d c e l l s ( 4 6 ) . T h u s , PBP 2 i s a p p a r e n t l y e s s e n t i a l i n t h e c o n t r o l o f e l o n g a t i o n o f c y l i n d r i c a l PG s a c c u l u s a n d i n m a i n t a i n i n g t h e r o d - s h a p e d m o r p h o l o g y o f E. c o l i . U n l i k e t h e o t h e r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t P B P s , PBP 2 p o s s e s s e s o n l y t h e t r a n s p e p t i d a s e a c t i v i t y ( 4 3 ) . M u t a n t s d e f e c t i v e i n PBP 3 a r e u n a b l e t o f o r m s e p t a , a n d t h e y c o n s e q u e n t l y g r o w a s l o n g f i l a m e n t o u s c e l l s ( 4 7 ) . F u r t h e r m o r e , f l - l a c t a m a n t i b i o t i c s w h i c h h a v e a f f i n i t y f o r PBP 3 b l o c k c e l l d i v i s i o n i n E. c o l i . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t PBP 3 i s s p e c i f i c a l l y a c t i v a t e d a t t h e t i m e o f c e l l d i v i s i o n a n d i s r e s p o n s i b l e f o r t h e s y n t h e s i s o f s e p t a l , o r

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I t i s n o t e w o r t h y t h a t , i n a d d i t i o n t o PBPs 1A, I B , 2 a n d 3 , a p e n i c i l l i n - i n s e n s i t i v e t r a n s g l y c o s y l a s e h a s b e e n i d e n t i f i e d a n d p u r i f i e d , w h i c h p o l y m e r i z e s u n c r o s s - l i n k e d PG ( 4 9 ) . H o w e v e r , i t s t i l l u n c l e a r w h a t r o l e , i f a n y , t h i s en zy me p l a y s i n PG p o l y m e r i z a t i o n i n v i v o . Th e 3 lo w m o l e c u l a r w e i g h t PBPs, d e s i g n a t e d PBPs 4 , 5 , a n d 6 , h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s D D - c a r b o x y p e p t i d a s e s w h i c h h y d r o l y z e t h e D - a l a n y l - D - a l a n i n e b o n d p r e s e n t a t t h e N- t e r m i n u s o f t h e p e n t a p e p t i d e i n t h e n e w l y s y n t h e s i z e d PG ( 5 0 , 5 1 ) . G e n e t i c a n d p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e s o f a r f a i l e d t o e l u c i d a t e t h e r o l e s o f t h e s e p r o t e i n s i n PG m e t a b o l i s m . F o r e x a m p l e , m u t a n t s d e f e c t i v e i n a n y o n e o f t h e s e e n z y m e s a r e v i a b l e a n d a p p a r e n t l y n o r m a l ( 5 2 ) . A l t h o u g h t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e s e e n z y m e s a r e n o t e s s e n t i a l , i t m u s t b e e m p h a s i z e d t h a t m u t a n t s c a r r y i n g m u l t i p l e m u t a t i o n s a f f e c t i n g t h e s e PBPs h a v e n o t y e t b e e n c o n s t r u c t e d . A t p r e s e n t , i t a p p e a r s t h a t t h e low m o l e c u l a r w e i g h t PBPs a r e i n v o l v e d i n t h e m a t u r a t i o n o f n a s c e n t PG b u t s p e c i f i c d e t a i l s r e m a i n t o b e d e t e r m i n e d ( 5 3 ) . T h i s t o p i c i s m o re a p p r o p r i a t e l y d i s c u s s e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . B o t h t h e t r a n s p e p t i d a s e a n d D D - c a r b o x y p e p t i d a s e a c t i v i t i e s o f t h e PBPs u t i l i z e t h e D - a l a n i n e m o i e t y o f t h e p e n t a p e p t i d e a s a s u b s t r a t e ( 5 4 ) . P e n i c i l l i n i s a n a n a l o g o f a c y l D - a l a n y l - D - a l a n i n e a n d t h u s c o m p e t e s w i t h t h i s s u b s t r a t e t o a c y l a t e t h e a c t i v e s i t e o f t h e PBPs. The p e n i c i l l o y l a t e d PBPs