HET EFFECT VAN ACETYLCYSTEÏNE
OP DE DETECTIE VAN BACTERIEN IN
DE BAARMOEDER VAN RUNDEREN
Aantal woorden: 8644
Gilles Collet
Studentennummer: 01405043
Promotor: Prof. dr. Geert Opsomer
Promotor: Leen Lietaer
Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde Academiejaar: 2019 – 2020
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
Preambule
Door de coronacrisis zijn er bepaalde bijkomende tests die niet uitgevoerd konden worden. Het is namelijk niet gelukt om de histologische coupes samen met professor Ducatelle te bespreken.
Voorwoord
Met veel enthousiasme ben ik enkele maanden geleden gestart met deze masterproef. Het microbioom van het rund is een relatief onbekend domein waar er nog veel over te leren valt en waar er regelmatig nieuwe wetenschappelijke ontdekkingen worden gedaan. Het was dan ook niet makkelijk om veel wetenschappelijke literatuur te vinden over dit onderwerp. Hiervoor wil ik vooral mijn promotoren prof. dr. Geert Opsomer en Leen Lietaer bedanken voor de vele suggesties, hulp en begeleiding.
Verder wil ik het slachthuis Flanders meat group Zele bedanken voor de verschillende malen dat ik er baarmoeders mocht gaan ophalen. Wegens de recente actualiteit rond slachthuizen en dierwelzijn is dit zeker geen evidente zaak. Hiervoor dus dank.
Ook wil ik Dgz bedanken voor het onderzoek van de stalen die ze hebben verricht en de snelle kennisgeving van de resultaten.
Als laatste wil ik mijn ouders en vriendin nog bedanken voor de vele steun die ik van hen heb gekregen gedurende mijn gehele opleiding diergeneeskunde.
Inhoudsopgave
1 Samenvatting ... 5
2 Literatuurstudie ... 6
2.1 Anatomische structuren die betrokken zijn bij uteriene infecties ... 6
2.1.1. Uterus ... 6
2.1.2. Ovaria ... 7
2.1.3. Hypothalamo-hypofysaire as ... 7
2.2 Pathogenen en factoren die bijdragen tot uteriene infecties ... 8
2.2.1. Bacterieel ... 8
2.2.2. Viraal ... 10
2.2.3. Immuniteit ... 11
2.3 Classificatie van uteriene infecties ... 11
2.3.1. Retentio secundinarum ... 12 2.3.2. Metritis ... 12 2.3.3. Klinische endometritis ... 13 2.3.4. Subklinische endometritis ... 15 2.3.5. Pyometra ... 16 2.4 Acetylcysteïne ... 17 3 Probleemstelling en doelstelling ... 19 4 Materiaal en methoden ... 19 5 Resultaten ... 21 5.1 Cytologie ... 21 5.2 Histologie ... 22 5.3 Bacteriologie ... 23 6 Discussie... 25 7 Conclusie ... 26 8 Referentielijst ... 27 9 Bijlagen ... 33
5
1 Samenvatting
Tijdens en onmiddellijk na het kalven krijgen tal van bacteriën, waaronder pathogenen, toegang tot de baarmoeder van het rund. Blijven deze pathogenen in de uterus aanwezig of is deze steriel? Dit is een vraag die onderzoekers zich de laatste jaren meer en meer stellen. Er is dan ook speculatie voor het bestaan van een baarmoedermicrobioom, maar de detectie hiervan blijft moeilijk. Redenen hiervoor zijn dat men uiterst steriel moet tewerk gaan om geen accidentele contaminatie te creëren vanuit de omgeving of darmtractus. Ook de mucus ter hoogte van de baarmoeder zou kunnen interfereren met de isolatie van deze kiemen. De hypothese die gesteld werd, was dat met behulp van acetylcysteïne, een mucolyticum, het slijm in de baarmoeder afgebroken zou kunnen worden. Hierdoor zou het makkelijker zijn om de aanwezigheid van bacteriën te detecteren. Voor deze studie werden 48 runderbaarmoeders verzameld in het slachthuis. Van alle baarmoeders werd een staal genomen van het endometrium, door middel van een cytobrush, waarop cytologisch het aantal neutrofielen ten
opzichte van de overige cellen bepaald werd. Als cut-off werd een waarde van 2 %
neutrofielen gehanteerd om de baarmoeder als positief te beschouwen. Uiteindelijk werden er 9 uteri met positieve cytologie verder onderzocht. Een compartiment van deze baarmoeders werd telkens ingespoten met acetylcysteïne of een controle vloeistof, en na incubatie werd deze vloeistof opnieuw geaspireerd om vervolgens bacteriologisch onderzocht te worden door Dgz. Er werd van elk staal een aërobobe bacteriële cultuur aangelegd, waarbij men zowel de bacteriekolonies identificeerde, als de kwantiteit ervan registreerde. Verder werden er ook histologische coupes gemaakt van de baarmoederwand. Deze studie toonde een prevalentie van (sub)klinische endometritis aan van 16,6%. Uit slechts 21 % van de stalen konden bacteriën geïsoleerd worden. Trueperella pyogenes (35,6%), Escherichia coli (22,2%),
Streptococcus pluranimalium (11,1%) en Enterococcus hirae (8,9%) waren de meest frequent
geïsoleerde bacteriën. In deze studie kon echter geen verschil worden aangetoond tussen de acetylcysteïnegroep en de controlegroep, wat betreft de isolatie van bacteriën uit de baarmoeder van runderen.
6
2 Literatuurstudie
2.1 Anatomische structuren die betrokken zijn bij uteriene infecties
2.1.1. Uterus
De wand van de uterus bicornis van het rund is samengesteld uit 3 lagen (zie figuur 2). Van buiten naar binnen worden deze perimetrium (serosa), myometrium, en endometrium (mucosa) genoemd (Bacha en Bacha, 2012).
Het myometrium bestaat uit 2 spierlagen die gescheiden zijn door een rijk gevasculariseerd en goed geïnnerveerd stratum vasculare. De binnenste spierlaag bevat circulaire gladde spiercellen en is de dikste van de twee. De buitenste spierlaag is dunner en bevat longitudinale gladde spiercellen. Het stratum vasculare kan echter bij de koe gelegen zijn in de buitenste helft van de ciruculaire spierlaag (Bacha en Bacha, 2012).
Het endometrium, dat de inwendige aflijning vormt van de uterus, is samengesteld uit een epitheellaag met kliertjes, die omgeven zijn door een ondersteunend bindweefsel die ook wel de lamina propria genoemd wordt (zie figuur 1). Het bovenste twee derde van dit endometrium noemt men de ‘functionalis layer’ (FL). Deze zal tijdens de reproductieve jaren van een vrouwelijk dier een continue cyclus doormaken van proliferatie en secretie, gevolgd door desquamatie tijdens de menstruatie (tenzij er implantatie is). Het is afgelijnd door een meerlagig tot pseudomeerlagig kubische tot cilindrisch epitheel. Bovenop dit epitheel is er een glycocalyx aanwezig (Dadarwal et al., 2017). De endometriële klieren die gelegen zijn tot in de
lamina propria hebben een vertakt patroon. Onder deze oppervlakkige laag ligt de ‘basalis
layer’ welke instaat voor de ondersteuning van de FL en zorgt voor een regeneratie van het endometrium na desquamatie. Al deze veranderingen zijn afhankelijk van een normaal functionerende hypothalamo-hypofysaire as (Colgan en McLachlin, 2008; Bacha en Bacha, 2012; Bulun, 2016). Het endometrium bij het rund bevat ook non-glandulaire gebieden. Deze regio’s worden karunkels genoemd en hebben een belangrijke functie bij de vorming van de placenta (Bacha en Bacha, 2012).
Figuur 1 en 2: Hematoxyline-eosine (HE) kleuringen tonen een doorsnede van het endometrium en van de gehele baarmoederwand respectievelijk. 1: pseudomeerlagig cilindrisch epitheel, 2: lamina propria, 3: bloedvat, 4: endometriële klier, 5: longitudinale spierlaag uit het myometrium, 6: circulaire spierlaag uit het myometrium, 7: serosa.
Het is algemeen aangenomen dat er een ‘gezond’ en normaal functionerend endometrium nodig is om in te staan voor de implantatie en voeding van de blastocyst, het embryo, en om de dracht te volbrengen. Bacteriële infecties kunnen deze werking echter verstoren. Tijdens een uteriene infectie is er namelijk een herkenning van Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP’s) door Pattern Recognition Receptors (PRR’s) die gelegen zijn op de endometriële cellen (Sheldon et al., 2008, Sheldon et al., 2009). De binding van deze PAMP’s zorgt zowel voor een immuunrespons (zie verder) als voor een shift in hormoonproductie door
1 3 2 4 7 1 2 4 5 6
7 het endometrium (Sheldon et al., 2008; Sheldon et al., 2009). Het endometrium staat normaal in voor de productie van prostaglandine F2 (PGF2) dat zorgt voor de luteolyse van het aanwezige corpus luteum. Tijdens uteriene infectie is er echter een omschakeling van de productie van PGF naar PGE. Deze heeft in tegenstelling tot PGF een luteotroop effect en kan zorgen voor een verlengde luteale fase waardoor er geen oestrus kan ontstaan. Tijdens de oestrus heeft de uterus namelijk een betere kans om een aanwezige infectie op te lossen (Sheldon et al., 2009).
De mucosale epitheliale aflijning van het geslachtsstelsel biedt een fysieke barrière tegen vasthechting en infiltratie van microbiële pathogenen. Bovenop het epitheel van de baarmoeder is er zoals eerder vermeld een glycocalyx aanwezig die waarschijnlijk ook dienst doet als een extra fysieke bescherming (Dadarwal et al., 2017). Ter hoogte van het endometrium zijn er PRR aanwezig. Deze PRR omvatten onder andere de Toll-like receptoren, andere PRR kunnen aanwezig zijn maar hier dient nog verder onderzoek rond te gebeuren. Deze PRR detecteren Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs) en PAMPs (zoals bacterieel DNA, LPS en lipiden). De binding van deze PAMPs aan de Toll-like receptoren geeft onder andere een vrijstelling van pro-inflammatoire cytokines door activatie van nuclear factor kappa B (NFkB). Chemokines worden ook vrijgesteld en trekken op hun beurt neutrofielen en macrofagen aan. Het aanwezig blijven van deze neutrofielen is gelinkt met het voorkomen van subklinische endometritis en infertiliteit (Sheldon et al., 2009; Dadarwal et al., 2017). Endometriële epitheliale cellen kunnen ook pathogenen afstoten. Secreties afkomstig van deze epitheelcellen bevatten een grote variëteit aan niet-specifieke antimicrobiële peptiden en proteïnen. De manier waarop de secretie van deze antimicrobiële peptiden en proteïnen wordt gecontroleerd is nog redelijk onbekend. Bepaalde cytokinen kunnen de vorming van deze stoffen echter beïnvloeden. Ook de plaats ter hoogte van het baarmoederlumen waar deze antimicrobiële peptiden gesecreteerd worden, kan verschillen. Een mogelijke verklaring zou zijn dat de secretie van antimicrobiële peptiden afhankelijk is van welke, hoeveel en waar bacteriën aanwezig zijn in de baarmoeder. In vitro testen ondersteunen dit en toonden aan dat endometriële cellen die gestimuleerd werden met lipopolysacchariden (LPS) verschillende
antimicrobiële peptiden secreteerden, waaronder -defensin-4, -defensin-5, Lingual
antimicrobial peptide en tracheal antimicrobial peptide (Sheldon et al., 2009; Dadarwal et al.,
2017).
2.1.2. Ovaria
Runderen met uteriene infecties hebben minder kans om te ovuleren. Het follikelvocht van deze dieren die lijden aan uteriene infecties bevatten LPS die afkomstig zijn van gramnegatieve bacteriën. Deze LPS worden herkend door Toll-like receptoren gelegen op de granulosa cellen (Sheldon et al., 2009). Dit zorgt op zijn beurt voor een lagere aromatase expressie wat leidt tot een lagere plasmaconcentratie van oestradiol in het bloed (Sheldon et al., 2009). Er is ook een verstoring van de hypothalamo-hypofysaire as (HHA), en een tragere groei van de post-partum dominante follikel (Sheldon et al., 2009).
2.1.3. Hypothalamo-hypofysaire as
De HHA is cruciaal om ovariële en endometriële cycliciteit in goede banen te leiden. Het bestaat uit een hypofyse die is opgehangen aan de hypothalamus. Deze hypofyse staat in voor de vrijstelling van verschillende hormonen die op hun beurt zorgen voor de beïnvloeding van andere endocriene klieren (Bacha en Bacha, 2012). Runderen die lijden aan post-partum uteriene infecties hebben een verstoring van deze HHA (Sheldon et al., 2009). LPS kunnen een oorzaak zijn van deze verstoring. Bij schapen uit zich dat bijvoorbeeld in een verlaagde secretie van Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) door de hypothalamus, en een verlaagde secretie van luteïniserend hormoon door de hypofyse. Ook de gevoeligheid van de
8 hypofyse voor het hormoon GnRH is gedaald (Karsch et al., 2009). De secretie van follikel stimulerend hormoon is echter niet verstoord (Sheldon et al., 2002). De algemene uitkomst van deze verstoring leidt er toe dat dieren minder kans hebben om te ovuleren (Sheldon et al., 2009).
2.2 Pathogenen en factoren die bijdragen tot uteriene infecties
Pathogene bacteriën zijn alomtegenwoordig in de post-partum baarmoeder van runderen (Sheldon et al., 2009). Post-partum bacteriële baarmoederontstekingen komen frequent voor bij hoogproductief melkvee (ongeveer de helft van alle runderen), en zorgen voor een daling in productie en fertiliteit (Sheldon et al., 2006; Sheldon en Owens, 2017). De voornaamste pathogenen die geïsoleerd worden uit baarmoeders van koeien die een post-partum uteriene infectie doormaken, zijn Escherichia coli, Trueperella pyogenes, anaërobe bacteriën en het boviene herpesvirus 4 (Scheldon et al., 2006; Scheldon et al., 2017). Wagener et al. (2014) kwamen tot dezelfde bevindingen en vermeldden ook dat Streptococcus uberis en Bacillus spp. frequent voorkomen in de post-partum baarmoeder van zowel gezonde als zieke runderen.
2.2.1. Bacterieel
Een eerste vraag die we ons moeten stellen is: ‘hoe raken pathogene bacteriën die post-partum uteriene aandoeningen veroorzaken tot in het baarmoederlumen?’. Er zijn namelijk verschillende fysieke en cellulaire barrières die ervoor zorgen dat bacteriën verhinderd worden toegang te krijgen tot de baarmoerder. Deze barrières zijn onder andere de sluiting van de vulva, vestibulo-vaginale constrictie, de cervix, cervico-vaginale mucus secretie en de epitheel barrière (Dadarwal et al., 2017). Ten eerste kunnen deze bacteriën afkomstig zijn uit de omgeving van het dier, en via de vagina en cervix tot in de uterus gebracht worden of opklimmen. De voornaamste bacteriën die geïsoleerd worden uit de baarmoeders van runderen die lijden aan metritis, zijn omgevingskiemen. Deze kiemen kunnen toegang krijgen tot de uterus tijdens het kalven (Sheldon et al., 2006; Bromfield et al., 2015; Sheldon et al., 2019). Ten tweede kunnen bacteriën via hematogene weg tot in het uteriene lumen raken
(Jeon et al., 2017). De derde mogelijkheid is dat er een ‘ontaarding’ van het
baarmoedermicrobioom plaats vindt. Een studie uitgevoerd door Moore et al. (2017) beschreef namelijk dat er in baarmoeders van zowel vaarzen die nog niet geïnsemineerd waren, als in baarmoeders van drachtige koeien de bacteriële stammen Proteobacteria, Bacteroidetes en Firmicutes frequent voorkomen (zie figuur 3). Deze stammen omvatten bacteriesoorten die frequent geassocieerd worden met post-partum uteriene aandoeningen. Ze kwamen tot de conclusie dat gezonde runderen een uterien microbioom hebben, en dat dit zich huisvest op het moment dat vrouwelijke dieren reproductieve volwassenheid bereiken. Het ontstaan van infectieuze uteriene aandoeningen zou mogelijk veroorzaakt kunnen worden door een overgroei van specifieke bacteriën en het onaangepast reactievermogen van het immuunsysteem (Moore et al., 2017).
9
Figuur 3: uit Moore et al. (2017) Deze figuur toont het relatieve voorkomen van de meest frequente (A),
middelmatig frequente (B), en minst frequente (C) bacteriële stammen, gedetecteerd in het endometrium van 10 maagdelijke vaarzen (melkvee), en het vruchtwater, de intercotyledonaire placenta, het cervicaal lumen en de uitwendige cervix (controle) van 5 Holstein-melkkoeien tijdens het laatste trimester van de dracht.
Zoals eerder vermeld, worden post-partum uteriene ziekten vaak geassocieerd met de isolatie van pathogene bacteriën, waaronder vooral Escherichia coli, Trueperella pyogenes,
Fusobacterium necrophorum en Prevotella spp. (Scheldon et al., 2017). Waarbij E. coli en T. pyogenes de meest prevalente kiemen zijn (Silva et al., 2008; Sheldon et al., 2009).
10 Gramnegatieve bacteriën zijn overheersend gedurende de eerste week post-partum en grampostitieve bacteriën nemen deze rol over gedurende de tweede tot derde week (Hussain et al., 1990). Hierna worden de kenmerken beschreven van enkele frequent geïsoleerde bacteriën die geassocieerd zijn met post-partum uteriene aandoeningen .
- Escherichia coli: Dit is een gramnegatieve, staafvormige, facultatief anaërobe
omgevingskiem. Deze bacterie zou de weg vrijmaken voor infectie met andere bacteriën en virussen (Sheldon et al., 2009). Tijdens kolonisatie van de uterus hecht deze kiem zich voornamelijk vast aan het oppervlak van het endometriële epitheel (Karstrup et al., 2017b). Infectie met E. coli vindt vooral plaats gedurende de eerste week post-partum (Dadarwal et al., 2017). E. coli komt echter ook voor in gezonde post-partum baarmoeders (Moore et al., 2017). Het is ook gebleken dat sommige
E. coli stammen die geïsoleerd werden uit post-partum onbehandelde
geïnfecteerde uteri, genen tot expressie brachten die leidde tot antimicrobiële resistentie en biofilm vorming (Kasimanickam et al., 2016).
- Trueperella pyogenes: Is een niet beweeglijke, grampositieve, facultatief anaërobe
bacterie. Ze komen voor als pleomorfe of coccïde staven. Tijdens infectie hecht ook deze bacterie zich vast aan het oppervlak van het endometriële epitheel (Karstrup et al., 2017a, Karstrup et al., 2017b). Deze kiem veroorzaakt de meest ernstige laesies ter hoogte van het endometrium (Bonnett et al., 1991). De stammen van T.
pyogens die geïsoleerd worden uit de uterus beschikken allemaal over
verschillende virulentiefactoren waaronder het virulentie gen ‘plo’ (Silva et al., 2008). Dit gen codeert voor het cholesterol-afhankelijke cytolysine pyolysine. Dit pyolysine wordt aangetrokken tot cholestrolrijke domeinen in celmembranen waar ze aggregeren om een porie te vormen, wat leidt tot osmotische sterfte van de cel (Jost en Billington, 2005). Daarnaast produceert T. pyogenes een groeifactor voor
F. necrophorum (Sheldon et al., 2009). Infectie met T. pyogenes vindt vooral plaats
vanaf de tweede tot vierde week post-partum (Dadarwal et al., 2017).
- Fusobacterium necrophorum: Dit is een gramnegatieve, staafvormige, obligaat
anaërobe kiem die tijdens infectie doordringt tot in de lamina propria van het endometrium (Karstrup et al., 2017a). F. necrophorum produceert een leukotoxine (Sheldon et al., 2009). F. necrophorum, A. pyogenes en Prevotella spp. werken synergistisch om de waarschijnlijkheid en de ernst van uteriene infecties te vergroten (Ruder et al., 1981; Sheldon et al., 2009).
- Prevotella spp.: Zijn gramnegatieve, staafvormige, obligaat anaërobe kiemen. Prevotella melaninogenicus produceert een stof die fagocytose door afweercellen
inhibeert (Sheldon et al., 2009).
- Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Enterococcus spp: Deze bacterie genera
worden frequent geïsoleerd uit runderbaarmoeders en zouden een rol kunnen spelen als potentiële pathogenen of opportunistische contaminanten (Wagener et al., 2015). Runderen geïnfecteerd met S. uberis hadden een grotere kans op klinische endometritis dan S. uberis negatieve dieren (Wagener et al., 2014).
2.2.2. Viraal
Het Bovine Herpesvirus 4 (BoHV-4) is het enige virus dat consistent wordt teruggevonden bij post-partum uteriene aandoeningen bij het rund (Thiry et al., 1992; Donofrio et al., 2007; Sheldon et al., 2009; Yang, 2018). Dit virus is alomtegenwoordig in rundvee en behoort tot de gammaherpesvirussen (Thiry et al., 1992; Yang, 2018). Deze pathogeen kan, zoals andere herpesvirussen, een latente infectie veroorzaken bij de gastheer door infectie van macrofagen (Donofrio en Santen, 2001; Ackerman, 2006). Het BoHV-4 heeft een tropisme voor endometriële epitheel- en stromacellen (Donofrio et al., 2007). Donofrio et al., (2008) toonden
11 aan dat de activatie van BoHV-4 getriggerd kan worden door prostaglandine E (PGE), E. Coli of LPS. Hieruit suggereerden Sheldon et al., (2009) dat er bij bacteriële uteriene infectie een vicieuze cirkel kan ontstaan, waar de productie van LPS door bacteriën zorgt voor een productie van PGE door endometriële cellen. Deze productie van PGE zal dan voor een activatie van het BoHV-4 zorgen, dat op zijn beurt endometriële cellen infecteert en zorgt voor verdere beschadiging van het endometrium. Yang, (2018) toonde echter aan dat BoHV-4 geen invloed heeft op het voorkomen van subklinische endometritis op het moment van kunstmatige inseminatie.
2.2.3. Immuniteit
Het ontwikkelen van post-partum uteriene ziekten is afhankelijk van de immuunrespons van de koe, en van de soort en het aantal bacteriën (Sheldon et al., 2006). Moore et al. (2017) beschreven evenzeer dat post-partum uteriene ziekten waarschijnlijk het resultaat zijn van een overgroei van bepaalde bacteriën en het reactievermogen van het immuunsysteem. Dit reactievermogen is tijdens de dracht gedaald omdat er gedurende de zwangerschap een onderdrukking is van de immuniteit. Indien deze immunosuppressie zich doortrekt tot na de partus dan kan dit de baarmoeder vatbaarder maken voor eventuele infectie door pathogenen (Sheldon et al., 2009). Het mag dus duidelijk zijn dat het immuunsysteem een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van post-partum uteriene ziekten.
Na de partus is er echter steeds een fysiologische actieve immuunrespons ter hoogte van de baarmoeder. Deze dient om ‘celdebris’ afkomstig van achtergebleven delen van de placenta en bacteriële contaminatie op te ruimen. Deze reactie komt ten einde na 4 tot 5 weken bij gezonde koeien. Een deel van de runderen zal echter een systemische ontstekingsreactie ontwikkelen tijdens de eerste 2 weken of een verlengde ontstekingsreactie ter hoogte van de baarmoeder (Dadarwal et al., 2017).
Het blijkt dat een systemische ontstekingsreactie, zelfs in de afwezigheid van een actieve bacteriële infectie, kan interfereren met het overleven van het embryo (Sheldon et al., 2006). Zo kan mastitis zorgen voor een verlaagde ‘pregnancy rate’ en een verhoging in het aantal inseminaties die nodig zijn om dracht te bereiken (Hansen et al., 2004).
Na de partus volgt er een eerste ovulatie en de vorming van een eerste corpus luteum die op zijn beurt progesteron produceert. Dit progesteron heeft een immunosuppressief effect op de afweercellen van de uterus en kan zo bijdragen tot de vorming van post-partum uteriene ziekten (Sheldon et al., 2006). Dit werd bevestigd in een studie waar men T. pyogenes en E.
coli inbracht in de uterus van post-partum vleeskoeien. Hier zag men enkel het ontstaan van
uteriene infectie wanneer de plasmaconcentratie van progesteron begon te stijgen (Del Vecchio et al., 1992).
De relatie tussen uteriene bacteriën, de ontstekingsreactie en de ovariële activiteit is complex en vereist verder onderzoek (Sheldon et al., 2006; Dadarwal et al., 2017).
2.3 Classificatie van uteriene infecties
Microbiële aandoeningen van het vrouwelijke geslachtsstelsel komen frequent voor en hebben grote economische gevolgen vooral bij de mens en bij rundvee (Ross, 2002; Sheldon et al., 2006). De samenstelling en diversiteit van het uteriene microbioom bij melkvee is weinig gekend, maar het wordt steeds duidelijker dat deze lokale flora een cruciale rol speelt in de ontwikkeling van metritis en endometritis (Wagener et al., 2014). Microbieel geassocieerde uteriene infecties beïnvloeden de helft van al het melkvee na de partus. Het veroorzaakt infertiliteit door het verstoren van de uteriene en ovariële functie (Scheldon et al., 2009). Deze
12 uteriene infecties zorgen voor een ontsteking ter hoogte van de baarmoeder. Dit inflammatoire milieu veroorzaakt suboptimale omstandigheden voor onder andere spermatransport en -opslag, maturatie van oöcyten en ovulatie, ontwikkeling van de zygote, implantatie, embryonale en foetale groei (Gilbert, 2011).
2.3.1. Retentio secundinarum
Het opblijven van de nageboorte bij runderen wordt gedefinieerd als het falen om de foetale
membranen uit te stoten binnen de 12 tot 24h post partum (Paisley et al., 1986; Fourichon et al., 2000; Drillich et al., 2006). Retentio secundinarum (ret sec) wordt vaak geassocieerd met metritis (Drillich et al., 2003). Deze associatie zou de hoofdreden zijn voor de verminderde fertiliteit bij runderen die lijden aan ret sec (Laven en Peters, 1996). Risicofactoren voor ret sec zijn doodgeboorte van het kalf, abortus, tweelingen, dystocie en toenemende leeftijd (Joosten et al., 1987). De incidentie van ret sec bedroeg ongeveer 4% volgens een studie van Joosten et al. (1987) bij 160 188 Meuse-Rhine-yssel runderen. Deze incidentiecijfers komen overeen met andere studies waar een percentage van 4 tot 13,1% werd gevonden (Drillich et al., 2003; Goshen en Sphigel, 2006).
De behandeling van ret sec is al enige tijd een bron van discussie. Een veelgebruikte behandelingsmethode is het manueel verwijderen van de nageboorte en het lokaal behandelen met antibiotica (Laven en Peters, 1996). Sommige studies hebben echter aangetoond dat het intra-uterien manipuleren van de nageboorte nefast is voor de uteriene beschermingsmechanismen. Ook heeft deze manipulatie geen positief effect op de fertiliteit (Laven en Peters, 1996, Drillich et al., 2006). Het uitsluitend behandelen van ret sec met lokale intra-uteriene antibiotica zoals oxytetracycline zorgt voor een daling van de daaropvolgende koorts (Stevens et al., 1995). Het bleek echter geen effect te hebben op zowel de reproductieve capaciteit als op de melkproductie in vergelijking met koeien die geen behandeling kregen (Goshen en Sphigel, 2006). Het lokaal behandelen met antibiotica, in het bijzonder tetracyclines, kunnen zelf de loslating van de nageboorte uitstellen door onder meer hun eigenschap om matrix metalloproteinases te inhiberen (Gilbert et al., 2016). Het selectief behandelen van koeien die lijden aan ret sec, die ook koorts hebben, met enkel ceftiofur is minstens even effectief als het behandelen van alle koeien post partum met intra-uteriene antibiotica samen met het selectief toedienen van systemische antibiotica (Drillich et al., 2007). Ceftiofur zou helpen om ziekte te verminderen die voortkomt uit ret sec in koortsige koeien (Beagley et al., 2010). Het dient echter vermeld te worden dat ceftiofur een cephalosporine is dat behoort tot de derde generatie. Deze antibiotica worden in België beschouwd als kritisch en zijn aan beperkingen in gebruik onderhevig.
2.3.2. Metritis
Metritis wordt gedefinieerd als een infectie van de baarmoeder binnen de 21 dagen post-partum met de grootste frequentie van voorkomen binnen de eerste 10 dagen (Sheldon et al., 2009; Sheldon en Owens, 2017). Het is gekarakteriseerd door een vergrote, atonische uterus die een waterige rood-bruine tot visceus witte purulente vloeistof uitscheidt die vaak een stinkende geur heeft (Sheldon et al., 2009; Pascottini en Opsomer, 2016). De incidentie van metritis verschilt tussen land, ras en kudde; zo bleek in een studie die uitgevoerd werd op 97318 runderen door Zwald et al. (2004) dat het voorkomen van metritis (inclusief ret sec) lag rond de 21 %. Gilbert et al. (2016) ondersteunden deze bevindingen in hun artikel waar ze een percentage van voorkomen van 15 tot 20 % beschreven. Metritis komt ook meer frequent voor bij melkvee dan bij vleesvee en heeft een hogere prevalentie in primipare koeien (Gilbert et al., 2016).
Jeong et al. (2016) beschreven dat metritis een negatief effect heeft, zowel op de productiehoeveelheid als op de persistentie van de melkgift. Ook in andere studies werden
13 resultaten gevonden die aantonen dat de melkgift lager ligt bij runderen die aan het begin van de lactatie metritis hadden (Goshen en Shpigel, 2006; Giuliodori et al., 2013). Runderen die leden aan puerperale metritis hadden gemiddeld een tussenkalftijd van 409 dagen in vergelijking met gezonde runderen die gemiddeld een tussenkalftijd hadden van 389 dagen (Giuliodori et al., 2013). Risicofactoren voor metritis zijn ret sec, geboorteproblemen, tweelingdracht en een pre-partum verhoging van nonestrified fatty acids (NEFA’s) in het bloed (Giuliodori et al., 2013; Gilbert, 2016).
De ernst van metritis wordt gekarakteriseerd door de gezondheid van het dier in beschouwing te brengen. Sheldon et al. (2009) onderscheidde hier 3 categoriën op basis van klinische ziektetekenen.
- klasse 1: (klinische metritis) Het rund heeft een abnormaal vergrote uterus met een purulente uitvloei, zonder systemische tekenen van ziekte (Sheldon et al., 2009). - klasse 2: (puerperale metritis) Dieren die dezelfde symptomen hebben als klasse 1
maar bijkomend ook systemische klachten krijgen zoals koorts (>39,5°C), sufheid en dalen in melkproductie (Sheldon et al., 2009).
- Klasse 3: (toxische metritis) Dit zijn dieren die tekenen van toxemie vertonen, zoals
verlies van eetlust, koude extremiteiten, depressie en/of collaps. De prognose voor deze dieren is negatief (Sheldon et al., 2009).
Als behandeling werd beschreven dat intra-uteriene antibiotica (tetracyclines) helpen om de nadelige effecten van metritis op reproductie en melkproductie te verminderen (Goshen en shpigel, 2006). Het veelvuldig gebruik van deze antibiotica is echter de laatste tijd aan discussie onderhevig, gezien er toch nog twijfel is rond de efficaciteit, en ook de toenemende resistentie problematiek zorgt ervoor dat deze antibiotica doordacht gebruikt moeten worden (Drillich et al., 2001). Het systemisch gebruik van antibiotica zoals ceftiofur bij runderen met abnormale vaginale uitvloei op dag 4 tot 6 na de partus, en een rectale temperatuur van meer dan 39,5°C, is een veelgebruikte behandeling (Drillich et al., 2001; Pascottini en Opsomer, 2016). Chenault et al. (2004) kwamen tot het besluit dat een behandeling met ceftiofur gedurende 5 dagen effectief was voor de behandeling van acute post-partum metritis.
2.3.3. Klinische endometritis
Klinische endometritis wordt gedefinieerd als het voorkomen van een purulente uitvloei uit de vagina afkomstig van de baarmoeder meer dan 21 dagen post-partum, of een mucopurulente uitvloei vanaf dag 26 post-partum (Sheldon et al., 2009; Pascottini en Opsomer, 2016; Sheldon en Owens, 2017). De incidentie van klinische endometritis hangt af van het land, het ras en de kudde maar ligt gemiddeld rond de 10 tot 20 % (Sheldon en Owens, 2017). Een studie die uitgevoerd werd in Canada op 1865 runderen gaf een incidentie weer van 16,9% (LeBlanc et al., 2002). Risicofactoren die geassocieerd zijn met klinische endometritis zijn ret sec, geassisteerde kalving, doogeboorte van het kalf, oplopend bekken, primipariteit en mannelijke kalveren (Timothy et al., 2010). De financiële impact van klinische endometritis op de moderne veehouderij uit zich door een hoger percentage van vroegtijdige afvoer, minder melkproductie, behandelingskosten en een lagere fertiliteit (Lefebvre en Stock, 2012).
Vaginale uitvloei ofwel ‘purulent vaginal discharge’ (PVD) hoeft niet noodzakelijk enkel het gevolg te zijn van klinische endometritis maar kan ook voortkomen uit een vaginitis/cervicitis of zelf uit een combinatie van beide (Dubuc et al., 2010; Pascottini en Opsomer, 2016). Zoals zichtbaar is in figuur 2 kunnen runderen dus een PVD hebben die enkel afkomstig is van een cervicitis/vaginitis (‘PVD’ in figuur 4). Dieren kunnen ook enkel een subklinische endometritis hebben (‘Cyto’ in figuur 4), of een combinatie van deze beide die dan gedefiniëerd wordt als een klinische endometritis (‘Both’ in figuur 4) (Dubuc et al., 2010). Het voorkomen van endometritis is 13 %, van cervicitis/vaginitis is 11 %, en 32 % van de dieren lijdt aan beide
14 aandoeningen (Deguillaume et al., 2012). De nadelige invloeden van zowel cervicitis/vaginitis als van endometritis op de reproductieve capaciteit zijn additief (Dubuc et al., 2010; Guillaume et al., 2012).
Figuur 4: uit Dubuc et al. (2010) Deze figuur toont aan dat runderen enkel een ‘purulent vaginal discharge’ (PVD) (cervicitis/vaginitis) of subklinische endometritis (cytologische endometritis, CYTO) kunnen krijgen of een combinatie van deze beide (klinische endometritis).
Mogelijke manieren van diagnose zijn vaginoscopie, metri-check, echografische beeldvorming van de uteriene inhoud of de dikte van de uteriene wand, cytologie van een uteriene lavage of cytologie via een cytobrush waarbij deze laatste de meest betrouwbare methode was om endometritis te diagnostiseren (Barlund et al., 2008). Runderen met klinische endometritis hadden een 17,9% lagere kans op conceptie na eerste inseminatie en hadden gemiddeld 24 extra ‘open’ dagen (Barlund et al., 2008).
Sheldon et al. (2006) beschreven een scoresysteem die een score gaf aan de vaginale uitvloei op basis van kleur (score 0 tot en met 3, zie figuur 5) en geur (score 0 = geurloos en score 3 = stinkende geur). Op basis van kleur kan zowel een inschatting gemaakt worden van de soort bacteriën die aanwezig zijn als van de hoeveelheid bacteriën die aanwezig zijn. Williams et al. (2005) beschreven dat een muco-purulente uitvloei meer geassocieerd was met de aanwezigheid van F. necrophorum terwijl een purulente uitvloei meer geassocieerd was met de aanwezigheid van T. pyogenes en Proteus spp.
Figuur 5: uit Sheldon et al. (2006) deze figuur toont stalen van verschillende soorten vaginale uitvloei: score 0 = heldere mucus; score 1 = mucus die vlokken etter bevat; score 2 = uitvloei die ≤ 50% mucopurulent bevat; score 3 = uitvloei die ≥50% purulent materiaal bevat (occasioneel kan er een bloederige uitvloei aanwezig zijn)
Momenteel zijn er 2 populaire therapeutische opties die gebruikt worden voor de behandeling en de preventie van klinische endometritis: het gebruik van antibiotica (zowel intra-uterien als parenteraal) en het gebruik van prostaglandines (PG) (Lefebvre en Stock, 2012). Het principe
15 van PG is dat ze ervoor zorgen dat er een luteolyse van het corpus luteum plaatsvindt waardoor oestrus wordt geïnduceerd en er contractie is van de baarmoeder. Door deze contractie wordt alle inhoud naar buiten geduwd en kan de baarmoeder zichzelf ‘reinigen’. Uit een systematische review van Lefebvre en Stock. (2012) en een recente meta-analyse van Haimerl et al. (2018) blijkt echter dat PG geen effectieve behandeling is voor klinische endometritis. Het eenmalig intra-uterien gebruik van cephapirine vanaf dag 26 post-partum bij runderen die lijden aan klinische endometritis is wel een efficiënte behandeling (Lefebvre en Stock, 2012; Tison et al., 2017).
2.3.4. Subklinische endometritis
Subklinische endometritis speelt een belangrijke rol in de moderne melkveehouderij (Pascottini en Opsomer, 2016). Het wordt gekarakteriseerd door een ontsteking van het endometrium zonder de klinische tekenen van klinische endometritis zoals purulente uitvloei (Sheldon et al., 2009). Door deze ontsteking is er een stijging van het aantal polymorfonucleairen (PMN) in het uteriene lumen (Sheldon et al., 2006). Deze aandoening zou voortkomen uit een klinische endometritis die zich al in een stadium van genezing bevindt, uit trauma, of andere niet microbiële ziekten (Sheldon et al., 2009). Aangezien subklinische endometritis niet visueel kan gediagnostiseerd worden, zijn andere manieren nodig om de aandoening te bevestigen. Andere middelen om tot een diagnose te komen zijn histopathologie, echografie, leukocyt esterase strips (LES) en cytologie van het endometrium (Pascottini en Opsomer, 2016). Koeien met subklinische endometritis hebben een lagere kans om drachtig te worden na inseminatie (Pascottini et al., 2017).
- Histopathologisch onderzoek van baarmoederbiopten wordt als de gouden standaard
aanzien voor het detecteren van zowel acute als chronische endometriële schade (Chapwanya et al., 2010; Pascottini en Opsomer, 2016). Echter, deze methode wordt bij rundvee weinig tot niet gebruikt aangezien het tijdrovend, niet economisch verantwoord en eventueel schadelijk zou zijn voor de verdere fertiliteit (Sheldon et al., 2006). Chapwanya et al. (2010) weerlegden echter dit laatste argument en toonden aan dat het nemen van endometriële biopten niet nadelig is voor de verdere vruchtbaarheid.
- Cytologie is momenteel de meest gebruikte techniek om subklinische endometritis te
diagnostiseren (Sheldon et al., 2006; Dubuc et al., 2010). De diagnose van subklinische endometritis hangt hierbij af van de proportie van PMN in verhouding tot de epitheelcellen (Sheldon et al., 2006; Pascottini et al., 2017). De criteria voor het bepalen van deze cut-off zijn de daaropvolgende drachtpercentages (Dubuc et al., 2011). Het nemen van stalen voor cytologisch onderzoek van de baarmoeder bij koeien kan via 2 manieren; de eerste mogelijkheid is via cytobrush en de tweede is via een low volume lavage (LVL). Bij deze LVL zal men een klein volume (grootte-orde 100ml) fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl) via een spuit en flexibele infuusstaaf in de uterus inspuiten. Deze vloeistof wordt opnieuw geaspireerd en gecentrifugeerd. Vervolgens wordt er een druppel van het sediment op een draagglaasje aan de lucht te drogen gelegd zodat dit gekleurd kan worden en microscopisch beoordeeld kan worden.
- LES detecteren het enzyme leukocyt esterase dat wordt geproduceerd door
neutrofielen. LES worden daarom gebruikt als een indirecte methode voor het detecteren van ontstekingsreacties. LES kunnen gebruikt worden als een cow-side test voor het detecteren van subklinische endometritis (Denis-Robichaud en Dubuc, 2015; Schyndel et al., 2018).
- Echografie wordt in de praktijk vaak gebruikt om het vrouwelijk geslachtsstelsel van
16 het gebruik van deze diagnostische techniek voor het erkennen van subklinische endometritis blijkt onbetrouwbaar te zijn in de afwezigheid van bijhorende cytologische preparaten (Kasimanickam et al., 2004; Barlund et al., 2008; Pascottini en Opsomer, 2016).
Er was lange tijd geen consensus over het correct nemen en interpreteren van cytologische stalen van de baarmoeder (Pascottini en Opsomer, 2016). Dit leidde tot een grote variatie in cut-off levels voor het toegelaten percentage PMN, hetgeen op zijn beurt een grote variatie in voorkomen van subklinische endometritis gaf (Pascottini en Opsomer, 2016). Een studie van Gilbert et al. (2005) legde het gemiddeld voorkomen van subklinische endometritis rond de 53 %, maar beschreef dat er een grote variatie is tussen verschillende kuddes die kan lopen van 37 % tot 73 %. Baranski et al. (2012) beschreven ook dat het voorkomen van subklinische endometritis stijgt naarmate de cut-off voor diagnose lager wordt. Pascottini et al. (2017) creëerden naar aanleiding van deze variatie een standaard voor diagnose. Ze namen hiervoor
een cut-off van 1 % PMN op moment van inseminatie en kwamen tot een prevalentie van
27,8 %. Subklinische endometritis heeft geen effect op de melkproductie (Dubuc et al., 2011). De behandeling van subklinische endometritis gebeurt vooral via intra-uteriene infusie van
cephapirine of systemische injectie met PGF2. Beide behandelingen staan echter onder
discussie (Pascottini en Opsomer, 2016). Een recente studie beschreef een uteriene lavage met 500-600ml aan steriele fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl) als mogelijke behandeling voor subklinische endometritis (Dini et al., 2015).
2.3.5. Pyometra
Een pyometra wordt gekarakteriseerd door de opstapeling van purulent of mucopurulent exsudaat in de uterus in de aanwezigheid van een actief corpus luteum in acyclische runderen (Sheldon et al.,2006; Gilbert et al., 2016). Wanneer een uterus bacterieël gecontamineerd is, is de ovulatie van de follikels vertraagd (Sheldon et al., 2002). Wanneer er toch een dominante follikel ovuleert, is er een kans dat het beschadigde endometrium niet in staat is om voldoende prostaglandines te produceren die op hun beurt moeten zorgen voor de luteolyse van het corpus luteum. (Gilbert et al., 2016). De diagnose van een pyometra kan gebeuren via rectale palpatie, maar is het meest betrouwbaar via echo. Echografisch is dan een ‘sneeuwvorming’ in de uterus zichtbaar en een actief corpus luteum op de eierstokken. Trueperella pyogenes is de kiem die het meest geïsoleerd wordt uit een pyometra (Ribeiro et al., 2015). De incidentie van pyometra is laag en ligt rond de 1-4% (Akordor et al., 1986; 2000; Sheldon en Owens, 2017).
De behandeling bestaat uit een eerste inspuiting van prostaglandines gevolgd door een tweede inspuiting 11 tot 14 dagen later waarna het rund in oestrus komt (Fazeli et al., 1980; Gilbert et al., 2016). De behandeling van deze aandoening resulteert meestal in luteolyse van het aanwezige corpus luteum en de expulsie van de uteriene inhoud. Het slagingspercentage na eerste behandeling met cloprostenol is 94,9%, en 9,3% van de dieren heeft een terugkeer van de pyometra na de eerste behandeling (Fazeli et al., 1980). De prognose na behandeling
met PGF2 is goed, 30% zal drachtig zijn na de eerste insematie en 80% van de dieren wordt
17
2.4 Acetylcysteïne
Acetylcysteïne is een derivaat van cysteïne met een acetylgroep gehecht aan zijn stikstofatoom. Zoals de meeste thiolen kan acetylcysteïne worden geoxideerd door een grote verscheidenheid aan radicalen, en kan het ook optreden als nucleofiel (donor van een elektronenpaar) (Samuni et al., 2013).
Figuur 6: uit Wikipedia, deze figuur toont de chemische structuur van acetylcysteïne. Deze is opgebouwd uit een thiolgroep (nr: 1) en een acetylgroep (nr: 2).
Acetylcysteïne heeft verschillende toepassingen in de praktijk en wordt onder andere gebruikt bij de behandeling van ademhalingsproblemen, om taai slijm op te lossen, en verschillende andere aandoeningen zoals paracetamol intoxicatie en cardiotoxiciteit (Samuni et al., 2013). De structuur van de mucus ter hoogte van het ademhalingsstelsel komt tot stand door mucines, die bestaan uit een polypeptide ruggengraat, met daarop glycanen die gestabiliseerd worden door disulfidebruggen (Vukusavljevic et al., 2017). Deze disulfidebruggen worden gevormd tussen thiolgroepen afkomstig van cysteïne-residuen. Belangrijk is dat deze bindingen reversiebel zijn en dus ook kunnen gereduceerd worden. Acetylcysteïne kan zorgen voor de reductie van deze dubbele bindingen en zorgt zo voor vrije thiolgroepen en het verbreken van het driedimensioneel netwerk.
Figuur 7: Uit Vukusavljevic et al., (2017) chemische reductie van een disulfidebrug en oxidatieve ‘folding’ van een thiolgroep als reversiebele reactie.
Acetylcysteïne heeft ook een anti-oxidatieve werking die kan worden toegeschreven aan de snelle reacties met • OH-, •NO2-, CO3•-- radicalen en aan het herstel van aangetaste
doelwitten in vitale cellulaire componenten (Samuni et al., 2013).
Het gebruik van acetylcysteïne in de diergeneeskunde heeft voornamelijk betrekking tot ademhalingspathologie en dan vooral bij het paard. Er zijn echter ook beschrijvingen van het 2
18 gebruik bij paarden in verband met de behandeling van endometritis. Ferris et al. (2015) beschreven dat acetylcysteïne de biofilm gevormd door E. coli afbrak en ook bactericied was voor E. coli bij paarden. Het verminderde ook het aantal colony forming units voor P.
Aeruginosa en K. pneumoniae maar gaf hier geen afbraak van de biofilm bij deze kiemen. Het
gebruik van acteylcysteine voor dezelfde toepassing bij runderen is echter veel minder courant. Tras et al. (2014) beschreven echter dat het gebruik van acetylcysteïne het succes van de therapie (intra-uteriene infusie van amoxicilline+clavulaanzuur) voor klinische endometritis zou kunnen vergroten en dat het ook zou kunnen zorgen voor een hoger drachtpercentage. Dit effect zou men kunnen toeschrijven aan het feit dat acteylcysteïne zorgt voor het verwijderen van overtollige mucus en biofilm. Hierbij wordt de viscositeit veranderd en zorgt dit voor een beter spermatransport. Daarnaast wordt voorgesteld dat het anti-inflammatoire en immunomodulatoire effect van acetylcysteïne op focale abcesvorming en oxidatieve stress zou kunnen bijdragen tot een hoger drachtpercentage (Tras et al., 2014). Adnane et al. (2018) hebben ook eerder acetylcysteïne gebruikt om cervico-vaginaal slijm op te lossen van runderen voor het opsporen van biomarkers in verband met de detectie van uteriene pathologie. Het bleek dat acetylcysteïne zorgde voor een betere detectie van cytokines en chemokines in het cervico-vaginaal slijm.
19
3 Probleemstelling en doelstelling
De samenstelling van het uterien microbioom, zowel bij geïnfecteerde als bij gezonde uteri, is niet makkelijk te achterhalen en dit om verschillende redenen. Als eerste moet men uiterst steriel te werk gaan zodat er geen accidentele contaminatie is met omgevingskiemen of kiemen die uit de darmtractus afkomstig zijn. Indien men steriel genoeg kan werken is er nog een tweede obstakel, namelijk het kunnen isoleren van een kiem uit de baarmoeder zelf. In de baarmoeder is er namelijk een muceus vocht aanwezig dat een bepaalde samenstelling heeft afhankelijk van waar het rund zich bevindt in de cyclus. Dit uterien vocht bestaat uit groeifactoren, hormonen, enzymen, transportproteïnen, ionen, lipiden, glucose, aminozuren en andere moleculen (Martins et al., 2018). Het muceus karakter van deze oplossing wordt veroorzaakt door o.a. proteoglycanen die verbonden zijn met elkaar via disulfidebruggen. De bacteriën aanwezig in de uterus kunnen als het ware gevangen worden gehouden in de driedimensionele structuur van deze grote moleculen. Het verbreken van deze disulfidebruggen kan via verschillende stoffen, hier gebruiken we N-acetyl-cysteïne. Met deze studie willen we uitklaren of het gebruik van dit mucolyticum kan bijdragen tot een meer kwalitatieve en kwantitatieve isolatie van bacteriën uit dit uterien milieu.
4 Materiaal en methoden
Voor deze pilootstudie werden er gedurende 1 jaar 48 runderbaarmoeders verzameld in het slachthuis. Voornamelijk koeien van het Belgisch Witblauwe ras, hierdoor werden er ook frequent tekenen van een of meerder keizersnedes aangetroffen. Onmiddellijk na het scheiden van de ingewanden van het karkas werden deze baarmoeders, inclusief eierstokken, afgezonderd van het darmpakket. Er werd steeds caudaal van de cervix gesneden. De verkregen baarmoeders werden bewaard in een frigobox en onmiddellijk naar het labo aan de universiteit van Gent vervoerd.
De baarmoeders werden telkens klaargelegd in de postitie waarin ze zich normaal ‘in vivo’ in het rund bevinden (zie fig. 9: a,b). Er werd op dat moment een beschrijving gedaan van de aanwezige corpora lutea en follikels op de eierstokken. Deze bevindingen werden in een excelbestand bijgehouden. Vervolgens werd met behulp van een scalpelmes (nr.24) een kleine incicisie gemaakt van 2 à 3 cm, tot in het baarmoederlumen, ter hoogte van het corpus uteri. Via deze insnede werd er voorzichtig een cytobrush (Cytobrush Plus GT, Cooper Surgical, Berlijn, Duitsland) tot in het lumen gebracht en langzaam roterend een staal genomen van het endometrium (zie fig. 9: c). Het staal werd uitgesmeerd over een draagglaasje en aan de lucht te drogen gelegd. Vervolgens werd er een Diff-Quick kleuring op uitgevoerd (zie fig. 9: d,e,f). Deze preparaten werden dan uiteindelijk met behulp van een microscoop beoordeeld. De uitstijkjes waarbij het percentage neutrofielen ten opzichte van overige cellen evenveel of meer bedroeg dan 2% werden als positief beschouwd in deze proef (zie fig. 9: g). Enkel de baarmoeders die overeenkwamen met de positieve cytologie-preparaten werden verder in deze studie opgenomen.
In het eerste studie-opzet werden de baarmoeders met behulp van hechtdraad in 4 compartimenten onderverdeeld. Elke hoorn werd opgedeeld in 2 compartimenten (tip en mid) die zo goed mogelijk van elkaar gescheiden werden. Het bleek echter dat er niet genoeg spanning kon geplaatst worden met de hechtdraad, waardoor het compartiment mogelijk niet volledig afgesloten kon worden, en lekkage niet uitgesloten kon worden. Vervolgens zijn we op een tweede studie-opzet overgeschakeld, waarbij we met behulp van spanbandjes (strips) een mooiere afsluiting konden verkrijgen, alsook werden de baarmoeders maar in 2
20 compartimenten onderverdeeld, namelijk de linker en rechter hoorn (zie fig. 9: h,i). Er werd telkens zowel craniaal als caudaal van de hoorn een dubbele strip geplaatst om lekkage zoveel mogelijk te voorkomen.
Het injecteren van de vloeistof gebeurde zowel bij het eerste als bij het tweede studie -opzet na het afsluiten van elk compartiment en het ontsmetten van het oppervlak met ethanol 70%. Een vlinderkatheter (22G x 1”, Introcan®-W; B. Braun, Melsungen, Duitsland) werd onder een hoek van 45° geplaatst tot in het lumen van de baarmoederhoorn. Dit herhaalden we voor elk afgezonderd compartiment. Via deze katheter werd dan ofwel de testvloeistof 3,3 % N-acetyl-cysteïne (Lysomucyl® 10% oplossing, Zambon, Vicenza, Italië), ofwel de controlevloeistof
(fysiologische zoutoplossing, 0,9% NaCl, B. Braun, Melsungen, Duitsland) ingespoten. Tijdens het injecteren moet men er op letten dat het inspuiten van de vloeistof makkelijk en zonder weerstand kan gebeuren. Indien dit niet het geval is, is de kans groot dat men in de baarmoederwand aan het injecteren is. Er werd 10 ml vloeistof ingespoten per compartiment, die gedurende één uur ter plaatse bleef. Na dit uur (en het opnieuw ontsmetten van het oppvervlak met ethanol 70%) werd de vloeistof opnieuw opgetrokken. Deze opgetrokken hoeveelheid werd verdeeld over een epje (2 ml) dat naar Dgz werd verstuurd voor bacteriologisch onderzoek, en een 10 ml tube die werd ingevroren en bewaard als reserve. Verder werden er ook histologische coupes gemaakt van enkele positieve uteri. Hiervoor hebben we een weefselstaal genomen, bevattende alle lagen van de baarmoederwand, en in formol bewaard gedurende 2 dagen. Hierna werden deze in het labo van pathologie verder verwerkt tot coupes en gekleurd met Alcian Blue/PAS (AB/PAS).
In het labo van Dgz werd het staal op twee manieren verwerkt om de kans op bacterie-isolatie te verhogen. Ten eerste werd er 500 microliter van de verstruurde vloeistof gecentrifugeerd en werd de pellet uitgeplaat op een McConckey plaat, Bloedplaat en O plaat. Ten tweede werd er een swab van de spoelingsvloeistof uitgeplaat op een McConkey plaat, bloedplaat en O plaat. De identificatie van de bacteriekolonies gebeurde via maldi tof. De O plaat is een colombia agar base met 5% paardenbloed. Er werd ook een Streptococcus selectief supplement toegevoegd om de isolatie van Streptococcus kiemen te vergemakkelijken. De McConkey plaat is een selectieve indicator plaat om enterische gramnegatieve bacteriën te isoleren. Galzouten en kristal violet worden toegevoegd aan het medium en verhinderen de groei van grampositieve en ‘veeleisende’ gramnegatieve bacteriën zoals Pasteurella. Deze agar helpt om gramnegatieve lactose-fermenterende kiemen te differentiëren van gramnegatieve niet-lactose-fermenterende kiemen. Er is ook een kleurindicator toegevoegd die roze kleurt wanneer de pH daalt. Dit gebeurt wanneer lactose gefermenteerd wordt. Het wordt vooral gebruikt voor de isolatie van kiemen uit de familie van de enterobacteriaceae en
Pseudomonas spp. De bloedagar bevat bloed en wordt vooral gebruikt voor de islolatie van
Streptococcen en Staphylococcen. Deze kiemen verzoorzaken hemolyse die men kan waarnemen op de plaat. Deze hemolyse wordt onderverdeeld in alfa-, beta- en gammahemolyse. Alfahemolyse wordt waargenomen wanneer er vergroening is rond de kolonie, betahemolyse wordt gezien wanneer er een
heldere zone rond de kolonie ontstaat, en
gammahemolyse wordt vermeld wanneer hemolyse afwezig is. Deze platen werden overnacht geïncubeerd in een aëroob milieu.
Figuur 8: Figuur van een McConkey agar waarop er verschillende kolonies aanwezig zijn van E. coli.
21
Figuur 9: a,b: uteri in 'in vivo' positie, c: het inbrengen van de cytobrush in het lumen van baarmoeder, d,e,f: de 3 stappen van de Diff-Quick kleuring, g: microscopisch beeld van een uitstrijkje met meer dan 2% PMN, h,i: het plaatsen van de kathers in de afgesloten baarmoederhoornen.
5 Resultaten
5.1 Cytologie
Tijdens het uitvoeren van de proef werden in totaal 48 baarmoeders verzameld uit het slachthuis. Na cytologie en microscopische telling van elk uitstrijkje bleven er 9 baarmoeders over die aan de gestelde voorwaarde van minimaal 2% neutrofielen voldeden. Alle koeien vertoonden cycliciteit zoals te zien is in de 2e en 3e kolom uit tabel 1. Op deze ovaria werden
namelijk zowel follikels als corpora lutea gevonden. Het aantal dagen post-partum van elk rund is niet gekend aangezien het om slachthuispreparaten gaat.
Tabel 1: 1e kolom: nummers van de uteri die als positief beschouwd werden in deze proef, 2e en 3e kolom:
structuren die links (L) en rechts (R) aanwezig waren op de ovaria, 4e kolom: het percentage neutrofielen dat
gevonden werd in de als positief beschouwde uteri.
Uterus nummer L R % neutrofielen
2 Kleine follikels 2 Corpora lutea (1 corpus rubrum) 6
4 Follikels Corpus luteum 2
11 Niet aanwezig 3 Corpora lutea 10
13 Kleine follikels Grote follikel 2
22 Corpus luteum Grote follikel 2
34 Kleine follikels Oud Corpus luteum 34 (pyometra)
36 Oud Corpus Luteum + follikels Corpus luteum 2
40 Corpus luteum Kleine follikels + oud corpus luteum 7
44 Kleine follikels Corpus luteum 2
a b c f e i g d h
22 Tabel 1 toont dat baarmoeder nummer 34 het hoogste percentage aan neutrofielen heeft. Dit kunnen we verklaren door het feit dat hier een grote hoeveelheid mucopurulente inhoud aanwezig was (pyometra is waarschijnlijkheidsdiagnose). Verder zien we een voorkomen van neutrofielen van 2 tot 10% bij de andere baarmoeders. Over onze proef heen gezien hebben we een voorkomen van (sub)klinische endometritis van 16,6%. 1 dier leed dus waarschijnlijk aan een pyometra.
5.2 Histologie
In figuur 10 zien we telkens 2 coupes van uteri die behandeld werden met acetylcysteïne en 2 coupes van uteri die behandeld werden met de controlevloeistof. Uit deze figuren kunnen we afleiden dat er zowel bij de acetylcysteïne als bij de controlevloeistof een groot verschil is in behoud van de epitheel- en mucuslaag. In figuur A zien we paars-roze componenten ter hoogte van het cytoplasma van het epitheel, alsook een strak paars-roze laagje apicaal van de epitheellaag. We verwachten dat dit mucus-componenten, respectievelijk een deel van de mucuslaag is, die dus mooi behouden bleef na de testbehandeling terwijl in figuur B deze strakke aflijning ontbreekt en enkel de roze-paarse component ter hoogte van het cytoplasma nog te zien is. Beide uteri zijn behandeld met acetylcysteïne. Daartegenover staan figuren C en D die beide behandeld zijn met de controlevloeistof maar toch ook een verschil tonen in aanwezigheid van de mucus-componenten en mucuslaag.
Figuur 10: verschillende microscopische doorsneden die een AB/PAS beeld tonen van het endometrium, A (40x) en B (40x): doorsnedes na behandeling met acetylcysteïne, C (40x) en D (40x): doorsnedes na behandeling met de controlevloeistof.
In figuur 11 zien we hyperplasie van het endometrium-epitheel, waardoor het een meerlagig aspect krijgt . De epitheelcellen ogen eerder kubisch dan cilindrisch zoals we zien bij de andere
A B
23 preparaten. Deze coupe kwam namelijk van een uterus die leed aan een pyometra / endometritis.
Figuur 11: AB/PAS kleuring toont een hyperplasie van het endometrium
5.3 Bacteriologie
Tabel 2: Linker kolom: geïsoleerde bacterie spp., 2e kolom aantal stalen waar bacteriën in teruggevonden werd bij (sub)klinische endometritis koeien, rechter kolom: aantal stalen waar bacterie in teruggevonden is bij pyometra koe.
Geïsoleerde bacterie spp.
(sub)klinische endometritis koeien (8) aantal positieve stalen (%)
Pyometra koeien (1) aantal positieve stalen (%) Escherichia coli 10 (6,9%) / Trueperella pyogenes 8 (5,5%) 8 (5,5%) Enterococcus hirae 4 (2,7%) / Streptococcus uberis 2 (1,3%) / Streptococcus pluranimalium 5 (3,4%) / Streptococcus alactolyticus 2 (1,3%) / Staphylococcus sciurii 3 (2,0%) / Staphylococcus chromogenes 1 (0,7%) / Corynebacterium xerosis 1 (0,7%) / Rhodococcus rhodochrous 1 (0,7%) /
In bijlage 1 kan gezien worden welke stalen behandeld zijn met acetylcysteïne en welke behandeld zijn met de controlevloeistof. Er zijn te weinig cultuur-positieve stalen om een statistische analyse op uit te voeren die zou kunnen duiden op een eventuele werking van acetylcysteïne. Hierdoor werd niet verder beschreven of acetylcysteïne al dan niet voordelig is voor de isolatie van bacteriën. We kunnen echter wel afleiden welke kiemen geïsoleerd werden uit de onderzochte baarmoeders. Er zijn in totaal 24 stalen verstuurd naar Dgz afkomstig van 9 runderbaarmoeders. Van deze verstuurde stalen werden er 144 bacteriële culturen aangelegd. 11% bevatten Trueperella pyogenes, 6,9% bevatten Escherichia coli, 2,7% bevatten Enterococcus hirae, 6,0% bevatten streptococcus spp., 2,7% bevatten Staphylococcus spp., verder werd er ook eenmalig Rhodococcus rhodochrous en eenmalig Corynebacterium xerosis gevonden.
24
Figuur 12: Toont de relatieve verhouding van de geïsoleerde kiemen ten opzichte van elkaar.
verhouding aanwezige bacteriën
Escherichia coli (22,2%) Trueperella pyogenes (35,6%) Enterococcus hirae (8,9%) Streptococcus uberis (4,4%) Streptococcus pluranimalium (11,1%) Streptococcus alactolyticus (4,4%) Staphylococcus sciurii (6,7%) Staphylococcus chromogenes (2,3%) Corynebacterium xerosis (2,3%) Rhodococcus rhodochrous (2,3%)
25
6 Discussie
Pathogene bacteriën zijn alomtegenwoordig in de post-partum geïnfecteerde
runderbaarmoeder (Sheldon et al., 2009). Post-partum bacteriële baarmoederontstekingen komen frequent voor bij hoogproductief melkvee (ongeveer 50%), en zorgen voor een daling in productie en fertiliteit (Sheldon et al., 2006; Sheldon en Owens, 2017). Het is dus van belang dat bacteriën verantwoordelijk voor deze aandoeningen correct kunnen onderkend worden , zodat er een optimale behandeling kan ingesteld worden die kan leiden tot een minimalisatie van de economische schade en een maximalisatie van het dierwelzijn.
In deze studie werd een prevalentie van (sub)klinische endometritis gevonden van 16,6% in de door ons onderzochte runderbaarmoeders. Afhankelijk van de aangenomen drempelwaarde (% PMN) stijgt het aantal dieren gediagnostiseerd met subklinische endometritis naargelang de drempelwaarde daalt. Tijdens een studie uitgevoerd door Pascottini et al., (2017) op vlaamse melkveebedrijven kwam men tot een prevalentie van subklinische endometritis van 27,8% op het moment van inseminatie. Hier had men echter een
cut-off van 1 % PMN genomen. Hoe lager deze cut-off hoe hoger het aantal
gediagnostiseerde gevallen van subklinische endometritis (Baranski et al., 2012). Aangezien de drempelwaarde tijdens onze huidige proef lag op 2 % PMN was het te verwachten dat er een lagere prevalentie zou gevonden worden. Een andere studie uitgevoerd op 222 klinisch gezonde Holstein-Friesian melkkoeien in Polen legde het voorkomen van subklinische endometritis tussen de 18,9 en 75,4% afhankelijk van welke cut-off werd aangenomen voor diagnose (Baranski et al., 2012). Het voorkomen van klinische endometritis ligt gemiddeld rond de 10 tot 20 %, maar hangt af van het tijdstip na afkalven, het land, het ras en de kudde (Sheldon en Owens, 2017). Een studie die uitgevoerd werd in Canada op 1865 runderen gaf een incidentie weer van 16,9% (LeBlanc et al., 2002).
Deze studie toonde een waarschijnlijkheidsdiagnose van pyometra aan bij 1 dier. Procentueel gezien komt dit neer op een prevalentie van 2%. Als we dit vergelijken met enkele literatuurstudies komen deze resultaten overeen. De incidentie van pyometra is laag en ligt rond de 1-4% (Akordor et al., 1986; 2000; Sheldon en Owens, 2017). In tabel 2 kunnen we zien dat de enige kiem die geïsoleerd werd bij dit dier Trueperella pyogenes is. Volgens een studie van Ribeiro et al., (2015) is Trueperella pyogenes de meest geïsoleerde kiem in runderen die lijden aan een pyometra.
Gekende pathogene bacteriën die een rol spelen in de post-partum uteriene pathologie bij runderen zijn Escherichia coli, Trueperella pyogenes, Fusobacterium necrophorum,
Streptococcus uberis en Prevotella spp. (Sheldon et al., 2006; Wagener et al., 2014; Sheldon
et al., 2017). Andere bacteriën die behoren tot de familie van de Streptococcaceae, Bacillaceae, Enterococcaceae en Staphylococcaceae worden beschouwd al de meest frequent geïsoleerde intra-uteriene bacteriën (Wagener et al., 2015). Wanneer we de literatuur vergelijken met de verkregen resultaten van deze proef zien we een grote gelijkenis in geïsoleerde kiemen. Trueperella pyogenes, Escherichia coli, Streptococcus pluranimalium en
Enterococcus hirae waren de meest frequent geïsoleerde bacteriën tijdens deze studie. Deze
kiemen werden respectievelijk in 11%, 6,9%, 3,4% en 2,7% van het totale aantal stalen geïsoleerd. Verder werd er ook nog Streptococcus uberis aangetroffen in 1,3% van de stalen. Deze kiem werd ook aangetroffen door Wagener et al., (2014) in runderen met post-partum
26 baarmoederinfecties en zou gelinkt zijn met een grotere kans op het verkrijgen van klinische endometritis. Verder werd er ook nog Staphylococcus chromogenes en Staphylococcus sciurii gevonden. Ook deze kiemen werden door eerdere studies in verband gebracht met klinische endometritis bij runderen (Zhao et al., 2014).
Er waren te weinig cultuur-positieve stalen om een statistische analyse uit te voeren om het effect van acetylcysteïne te vergelijken met de controlevloeistof. Hierdoor werd niet verder beschreven of acetylcysteïne al dan niet voordelig is voor de isolatie van bacteriën.
Uit de histologische coupes kunnen we afleiden dat de mucuslaag ter hoogte van het endometrium zowel na behandeling met acetylcysteïne als na behandeling met de controlevloeistof soms behouden blijft en soms aangetast/beschadigd is. Onze hypothese, dat de mucuslaag grotendeels zou behouden blijven na behandeling met de controlevloeistof, en dat deze mucuslaag zou afgebroken worden door behandeling met acetylcysteïne, kon niet worden bevestigd. De reden hiervoor is niet gekend.
7 Conclusie
Het effect van acetylcysteïne op de isolatie van bacteriën uit de baarmoeder van runderen kon niet aangetoond worden. De geïsoleerde kiemen en prevalentiecijfers die gevonden zijn tijdens deze studie komen echter wel overeen met soortgelijke studies.
27
8
Referentielijst
Aagaard, K., Ma, J., Anthony, K.M., Ganu, R., Petrosino, J., Versalovic, J., 2014. The placenta harbors a unique microbiome. Science translational medicine 237, 237-265.
Ackermann, M., 2006. Pathogenesis of gammaherpesvirus infections. Veterinary Microbiology 113, 211-222.
Adnane, M., Kelly, P., Chapwanya, A., Meade, K.G., O’ Farelly, C., 2018. Improved detection of biomarkers in cervico-vaginal mucus from postpartum cattle. BMC Veterinary research 14, (297).
Akordor, F.Y., Stone, J.B., Walton, J.S., Leslie, K.E., Buchanan-Smith, J.G., 1986. Reproductive performance of lactating Holstein cows fed supplemental -carotene. Journal of Dairy Science 69, 2173-2178.
Bacha, W.J., Bacha, L.M., 2012. Female reproductive system. In: Color atlas of veterinary histology, Third Edn. Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, USA, pp. 243-265.
Baegley, J.C., Whitman, K.J., Baptiste, K.E., Scherzer, J., 2010. Physiology and treatment of retained fetal membranes in cattle. Journal of Veterinary Internal Medicine 24, 261-268. Baranski, W., Podhalicz-Dziegielewska, M., Zdunczyk, S., Janowski, T., 2012. The diagnosis and prevalence of subclinical endometritis in cows evaluated by different cytologic thresholds. Theriogenology 78, 1939-1947.
Barlund, C.S., Carruthers, T.D., Waldner, C.L., Palmer, C.W., 2008. A comparison of diagnostic techniques for postpartum endometritis in dairy cattle. Theriogenology 69, 714-723. Barlund, C.S., Carruthers, T.D., Waldner, C.L., Palmer, C.W., 2008. A comparison of diagnostic techniques for postpartum endometritis in dairy cattle. Theriogenology 69, 714-723. Bonnett, B.N., Martin, S.W., Gannon, V.P., Miller, R.B., Etherington, W.G., 1991. Endometrial biopsy in Holstein-Friesian dairy cows. III. Bacteriological analysis and correlations with histological findings. Canadian Journal of Veterinary Research 55, 168-173.
Bromfield, J.J., Santos, J.E.P., Block, J., Williams, R.S., Sheldon, I.M., 2015. Physiology and endocrinology symposium: uterine infection: linking infection and innate immunity with infertility in the high-producing dairy cow. Journal of Animal Science 93, 2021-2033.
Bulun, S.E., 2016. Physiology and pathology of the female reproductive axis. In: Williams textbook of endocrinology, Thirteenth Edn. Elsevier, Amsterdam, Nederland, pp. 589-663. Chapwanya, A., Meade, K.G., Narciandi, F., Stanley, P., Mee, J.F., Doherty, M.L., Callan, J.J., O’Farrelly, O., 2010. Endometrial biopsy: a valuable clinical and research tool in bovine reproduction. Theriogenology 73, 988-994.
Chenault, J.R., McAllister, J.F., Chester Jr, S.T., Dame, K.J., Kausche, F.M., Robb, E.J., 2004. Efficacy of ceftiofur hydrochloride sterile suspension administered parenterally for the treatment of acute postpartum metritis in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association 224, 1634-1639.
28 Colgan, T.J., McLachlin, C.M., 2008. Endometrial lesions, unusual tumors, and extrauterine cancer. In: Comprehensive cytopathology, Third Edn. Elsevier, Amsterdam, Nederland, pp. 247-271.
Dadarwal, D., Palmer, C., Griebel, P., 2017. Mucosal immunity of the postpartum bovine genital tract. Theriogenology 104, 62-71.
De Kruif, A., Van Der Wielen, N.J.G.J., Brand, A., Dieleman S.J., 1977. Behandeling van runderen lijdende aan een pyometra met oestrogenen en prostaglandinen. Tijdschrift Diergeneeskunde 102, 851-856.
Deguillaume, L., Geffré, A., Desquilbet, L., Dizien, A., Thoumire, S., Vornière, C., Constant, F., Fournier, R., Chastant-Maillard, S., 2012. Effect of endocervical inflammation on days to conception in dairy cows. Journal of Dairy Science 95, 1776-1783.
Del Vecchio, R.P., Matsas, D.J., Inzana, T.J., Sponenberg, D.P., Lewis, G.S., 1992. Effect of intrauterine bacterial infusions and subsequent endometritis on prostaglandin F2 alpha metabolite concentrations in postpartum beef cows. Journal of Animal Science 70, 3158-3162. Denis-Robichaud, J., Dubuc, J., 2015a. Determination of optimal diagnostic criteria for purulent vaginal discharge and cytological endometritis in dairy cows. Journal of Dairy Science 98, 6848-6855.
Dini, P., Farhoodi, M., Hostens, M., Van Eetvelde, M., Pascottini, O.B., Fazeli, M.H., Opsomer, G., 2015. Effect of uterine lavage on neutrophil counts in postpartum dairy cows. Animal Reproduction science 158, 25-30.
Donofrio, G., Herath, S., Satori, C., Cavirani, S., Flammini, C.F., Sheldon, I.M., 2007. Bovine herpesvirus 4 is tropic for bovine endometrial cells and modulates endocrine function. Reproduction 134, 183-197.
Donofrio, G., Vicky, L.S., 2001. A bovine macrophage cell line supports bovine herpesvirus-4 persistant infection. Journal of General Virology 82, 1181-1185.
Drillich, M., Beetz, O., Pfützner, A., Sabin, M., Sabin, H.J., Kutzer, P., Nattermann, H., Heuwieser, W., 2001. Evaluation of a systemic antibiotic treatment of toxic puerperal metritis in dairy cows. Journal of Dairy Science 84, 2010-2017.
Drillich, M., Klever, N., Heuwieser, W., 2007. Comparison of two management strategies for retained fetal membranes on small dairy farms in Germany. Journal of Dairy Science 90, 4275-4281.
Drillich, M., Mahlstedt, M., Reichert, U., Tenhagen, B.A., Heuwieser, W., 2006. Strategies to improve the Therapy of retained fetal membranes in dairy cows. Journal of Dairy Science 89, 627-635.
Drillich, M., Pfützner, A., Sabin, H., Sabin, M., Heuwieser, W., 2003. Comparison of two protocols for the treatment of retained fetal membranes in dairy cattle. Theriogenology 59, 951-960.
Dubuc, J., Duffield, T.F., Leslie, K.E., Walton, J.S., LeBlanc, S.J., 2010. Definitions and diagnosis of postpartum endometritis in dairy cows. Journal of Dairy Science 93, 5225-5233.
