Radio - immunochemische bepaling van de stilbenen, diethylstilbestrol (DES) hexestrol (HEX) en dienestrol (DE) in feces na chromatografische voorzuivering m.b.v. een Chromatolithe A kolom

Onderwerp: Radio-immunochemische bepaling van de stilbenen, diethylstilbestrol (DES) hexestrol (HEX) en dienestrol (DE) in feces na chromatografische voorzuivering m.b.v. een Chromatolithe A kolom

Verzendlijst: direkteur, sektorhoofden, direktie VKA, afdeling SERH (4x), medewerkers, projektbeheer, projektleider

(De Ruig), circulatie.

Projekt: Ontwikkeling residubepalingen voor dienestrol (DE) en hexestrol (HEX) m.b.v. behandeling van een aantal vleesstieren

Onderwerp: Radio-immunochemische bepaling van de stilbenen, diethyl -stilbestrol (DES), hexestrol (HEX) en dienestrol (DE) in feces na chromatografische voorzuivering m.b.v. een Chroma-tolithe A kolom

Voorgaand verslag: 84.6

Doel:

Onderzoek naar een methode voor de bepaling van de sttlbenen, diethyl -stilbestrol (DES), hexestrol (HEX) en dienestrol (DE), in stierenfeces met behulp van een radio-immunochemische bepaling.

Samenvatting:

Er is onderzoek verricht om analysemethoden voor DES, HEX en DE in stierenfeces te ontwikkelen. Als uitgangspunt werd Intern Analysevoor-schrift A 270, voor de bepaling van DES in runderurine, genomen. Er is aandacht geschonken aan de volgende parameters:

- extraktie

- Chromatolithe A kolom - RIA procedure.

Conclusie:

Het is mogelijk de stilbenen DES, HEX en DE in stierenfeces radio-immunochemisch te bepalen. Er zijn interne analysevoorschriften opgesteld, namelijk:

A 408 Bepaling van DES in stierenfeces A 409 Bepaling van HEX in stierenfeces A 407 Bepaling van DE in stierenfeces.

Verantwoordelijk: dr W.G. de Ruig Medewerker/Samensteller: G.D. van Projektleider: dr W.G. de Ruig

&

Brucltem

CfB'

dZ

1. Inleiding

Het bemonsteren van feces van dieren is in bepaalde gevallen gemakke-lijker uit te voeren dan het bemonsteren van urine (zgn. hengelen). Naar aanleiding van dit feit is de vraag gerezen of stilbenen (DES, !lEX en DE) in feces bepaald kunnen worden.

In dit verslag wordt beschreven welke parameters zijn onderzocht om te komen tot interne analysevoorschriften A 408 (A 409 of A 407): Vlees en vleesprodukten - Aantonen en bepalen van DES (HEX of DE) in

stierenfeces na chromatografische voorzuivering m.b.v. een Chromato-lithe A kolom.

Als uitgangspunt werd het intern voorschrift A 270 gehanteerd: Radio-immunochemische bepaling van DES in runderurine na chromatografische voorzuivering met behulp van een Chromatolithe A kolom.

2. \~erk\-lijze

Uitgaande van intern analysevoorschrift A 270 is elke stap in het voorschrift (hydrolyse, extraktie, chromatografische zuivering en RIA) hieronder beschreven.

2 .1 .!!_y~r~lzs~

Uit de literatuur (5.1 en 5.2) blijkt dat hydrolyse achterwege kan \-lorden gelaten, omdat de stilbenen ongebonden (geen derivaten met glu-curoniden en sulfaten) aanwezig zijn.

2.2 Extractie

Uit eerdere experimenten is gebleken dat extraktie van een feces/ watermengsel met lso-oktaan/ethylacetaat (90/10) zeer grote spreiding gaf in de opbrengsten (55-70%). De extraktie met ether verloopt beter en reproduceerbaarder met opbrengsten van 65-70%. Dit is alleen voor DES onderzocht.

2.2.1 Opbrengst

Om de opbrengst van de etherextraktie voor de drie stilbenen te bepa-len werd aan een fecesh-1atermengsel (0, 2 g/0 ,5 ml) 3H-DES of 3H-HEX of 3H-DE toegevoegd en gemengd. De feces werden 3x geextraheerd met 1 ml ether.

-Na droogdampen van de gezamenlijke etherextrakten werd het residu

op-genomen in ethanol. Een aliquot van deze oplossing werd gebruikt voor

de telling van de opbrengst van de 3 stilbenen.

DES HEX DE 1 x 1 ml ether 78 39 39 Terugvinding (%) 2 x 1 ml ether 93 71 67 3 x 1 ml ether 94 82 81

Vam-lege de varii~rende terugvindingen voor HEX en DE is de extraktie

nogmaals onderzocht. Daarbij werden bovenstaande resultaten niet meer

bereikt (50-65%). Daarom zijn andere extraktiemiddelen onderzocht. Om

de opbrengst te verhogen voor HEX en DE werd dezelfde procedure als

hierboven beschreven gevolgd, maar werden de feces met water,

water/ethanol of ethanol gemengd en vervolgens 3 x geextraheerd met

ether.

3H-HEX Terugvinding (%)

1 x 1 rol 2 x 1 ml 3 x 1 rol

ether ether ether

0,2 g feces

+

0,5 ml H20 16,2 38,7 54,7

0,2 g feces

+

0,5 ml H20/EtOH ( 1:1) 56,6 79,8 90,1

0,2 g feces

+

0,5 ml Et OH 36,5 64,5 64,5

Conclusie:

De extraktie van stilbenen uit feces verloopt het beste roet een

feces/water/ethanolmengsel en ether. Alhoe\olel t\-lee maal extraheren

feces/watermengsel voor DES voldoende lijkt te zijn, zal er

veilig-heidshalve drie maal geextraheerd worden met ether.

2.3.1 Recovery over de kolom

van

Ter controle van de opbrengst van de kolomzuivering werden oplossingen

3H.-DES, 3H-HEX en 3H-DE drooggedampt in glazen buisjes en de droogrest

- 3

-Het geheel werd op de kolom gebracht, die vooraf gespoeld was met 3 ml

iso-oktaan. De buisjes werden nagespoeld met 1 ml

iso-oktaan/ethyl-acetaat (90/10). Vervolgens werd geelueerd met 4 rol

iso-oktaan/ethyl-acetaat 80/20 en 6 ml lso-oktaan/ethylacetaat 60/40. De eluaten werden in 1 ml frakties opgevangen, drooggedampt en opgenomen in ethanol. Een

aliquot van de oplossingen werd geteld in de

vloeistofscintillatie-teller. In de eerste 4 frakties van de eluaten van iso-oktaan-ethyl-acetaat 60/40 werd het volgende gevonden.

Terugvinding (%)

60/40 fraktie restant in buisje achtergebleven op ~1~

DES 84 1,5 4,3

HEX 83 1,5 4,1

DE 83 1,5 11,1

Conclusie

Het blijkt dat DES, HEX en DE in de eerste 4 ml van de fractie lso-oktaan/ethylacetaat 60/40 voor meer dan 80% uitgevangen wordt.

Elutiepatronen voor DES, HEX en DE op de Chromatolithe A kolom.

De elutiepatronen kunnen vrij eenvoudig worden nagegaan als de

werk-wijze beschreven onder 2.3.1 wordt gevolgd.

Figuur 1, 2 en 3.

Elutiepatronen voor DES, HEX en DE op de Chromatolithe A kolom.

2.4 ~a~r!x!n~l~e~e~ ~p_d~ ~I~ ~r~c~d~r~

De RIA procedure, die gevolgd is, staat beschreven in Intern

Voor-schrift A 270: Radio-immunochemische bepaling van diethylstilbestrol

(DES) in runderurine na chromatografische voorzuivering m.b.v. een Chromatolithe A kolom.

Er is onderzoek gedaan naar de matrixinvloeden van feces op de stan-daardlijnen van DES en HEX. Voor de DE label is dit achterweg gelaten daar deze een te lage specifieke aktiviteit heeft.

-2.4.1 Invloed van fecesextrakt op de DES-standaardlijn

Blanco fecesmonsters werden geextraheerd met ether, gezuiverd over de Chromatolithe A kolom en de eluaten ingedampt. DES-standaarden en 3u-DES werden aan de residuen toegevoegd. Tezamen met een DES-standaardlijn wordt de RIA procedure ingezet. De resultaten worden weergegeven in figuur 4 en 5.

2.4.2 Invloed van feces, waaraan standaarden zijn toegevoegd, op de

standaardlijn in vergelijk met een ijklijn.

Aan blanco fecesmonsters werden standaarden en label (DES en HEX) toegevoegd. De fecesmonsters werden opgewerkt en gevolgd door de RIA procedure met een ijklijn van DES en HEX. De resultaten van DES en HEX worden gegeven in figuur 6 t/m 9.

Conclusie

De ijklijnen, verkregen door standaarden en standaarden aan feces toe te voegen, blijken nagenoeg hetzelfde (figuur 4 t/m 9) zodat er geen

matrixinvloeden zijn op de standaardlijnen van DES en HEX. Er kan voor

DES en HEX in feces worden volstaan met een direkte standaardlijn

(alleen RIA procedure).

3. Resultaten

3.1 !o~v~e~i~g~n_v~n_D!SL ~E! ~n_D! ~a~ ~l~n~o_f~ces

Aan blanco stierenfeces zijn op voor DES en HEX 2,25 ~g/kg en voor DE op 11,25 ~g/kg niveau standaarden toegevoegd en geanalyseerd volgens interne analysevoorschriften A 408 voor DES, A 409 voor HEX en A 407 voor DE.

toegevoegd teruggevonden terugvindingapercentage DES 2,25 llg/kg 2,28

.±.

0,16 (n=16) 70,7

.±.

6,9

HEX 2,25 }lg/kg 2,54

.±.

0,48 (n=16) 62,8

+

5,7 DE 11,25 ~g/kg 22,1

+

3,0 (n=l6) 57,6

.±.

5,1

3.2 !e~e~m~n~t~r~ ~a~ ~e_H~{D! ~t~e~e~p~oef

Er zijn praktijkmonsters geanalyseerd op HEX en DE. In beide gevallen

is gebruik gemaakt van 3u-HEX als radiolabel en een

- 5

-Wel zijn ijkcurves gemaakt aan de hand van HEX en DE standaardreeksen.

Daar we geen praktijkmonsters, die DES bevatten, hebben heeft dit

onderzoek niet kunnen plaatsvinden. Om een zo homogeen mogelijk monster te krijgen is 4 g feces met 6 ml water gemengd en is hieruit

een aliquot genomen voor de analyse.

HEX in feces (llg/kg)

RIKILT- 1e assay 2e assay 3e assay

nummer (terugvinding) (terugvinding) (terugvinding)

83/5078 18,0 (74%) 43,6 (62%) 34,6 (73%) 83/5090 22,7 (7 5%) 63,8 (55%) 41,7 (67%) 83/5090 21,0 (71%) 60,1 (62%) 34,9 (70%) 83/5090 24,5 (70%) 70,6 (64%) 40,5 (67%) 83/5090 22,3 (64%) 62,4 (54%) 37,6 (64%) 83/5102 11,0 (66%) 19,4 (60%) 15,1 (71%) 83/5114 1, 51 (7S%) 1,88 (SS%) 1,20 (71%) 84/S/0621/06 0,14 (76%) 0,28 (63%) 0,34 (69%) 83/S082 21,4 (73%) 64,4 (S9%) 39,0 (7 S%) 83/S094 10,9 (69%) 29,6 (61%) 21,6 (69%) B3/S106 0,49 (77%) 1,SO (60%) 0, 74 (68%) 83/Sll8 0,47 (6S%) 1,78 (63%) 1,24 (74%) 84/S/0621/10 0,42 (73%) 0,86 (S7%) 0,80 (77%) DE in feces (llg/kg)

RIKILT- 1e assay 2e assay 3e assay

nummer (terugvinding) (terugvinding) (terugvinding)

83/S076 18,2 (71%) 33,8 (65%) 52,5 (68%) 83/S088 10,1 (79%) 11,0 (S2%) 16,0 (71%) 83/5088 7,10 (71%) 9,93 (63%) 1S,4 (76%) 83/S088 12,4 (66%) 7, 92 (68%) 1S,2 (7 2%) 83/S088 13,7 (65%) S,83 (64%) 10,2 (75%) 83/S100 0,74 (70%) J.,SO (67%) 1,65 (68%) 83/5112 2,20 (72%) 2,S4 (67%) 3,86 (74%) 84/5/0621/04 2,03 (76%) 0,69 (S7%) 83/5080 43,5 (69%) S9,0 (69%) 83/5092 7,13 (70%) 6,36 (64%) 13,4 (66%) 83/5104 0,59 (76%) 1,36 (S5%) 2,44 (74%) 83/Sll6 1,83 (66%) 2,22 (61%) 4,00 (69%) 84/S/0621/08 0,88 (76%) 0,14 (56%) 0,40 (6S%) 8530.5 - 6

-Conclusie

De drie stilbenen zijn in feces te bepalen met een

terugvindingaper-centage van

>

60%. De intravariatiecoefficient voor HEX is 7% en voor

DE 25%. De intervariatiecoefficient voor HEX is 44% en voor DE 51%.

Deze hoge coef ficienten zijn onder andere te to~ij ten aan de

inhamogeni-telt van de monsters en voor DE wordt deze bepaald met 3H-HEx als

label en een antiserumverdunning als die voor HEX.

4. Eindconclusie

Het bepalen van de stilbenen DES, HEX en DE in feces kunnen geanaly

-seerd worden volgens de interne analysevoorschriften A 409, A 408 en

A 407.

5. Literatuur

5.1 Aschbacher, P.W.

Diethylstilbestrol metabolism in Food-producing animals.

J. of Toxicology and Environmental Health, Suppl. 1, 45-59, 1976.

5.2 LaschUtza,

w.

Entto~icklung eines Radioimmunologischen Verfallrens zur Bestimmung der

Anabol wirksamen Substanz Diäthylstilböstrol (DES) im Blutplasma und

in esabaren Geweben vom Rind, 1980.

5.3 De Ruig, W.G., Polman, Th.H.G.

Rapport 84.94

Bepalen van de titer en de specificiteit van het RIVH DES-antiserum

0646/0647 en het Hoechst stilbeenantiserum 6139 met 3H-HEX of 3H-DE

als gelabeld antigeen.

5.4 De Ruig, W.G., Berghmans, M.C.J., Polman, Th.H.G.

RIKILT intern analysevoorschrift A 270

Radio-immunechemische bepaling van dietltylstilbestrol (DES) in

runder-urine na chromatografische voorzuivering met behulp van een chromato

i

!

I Figuur. 1

- - - -

·

-K 0 L 0 1·1: C H

F:

0 11 A T 0 L I T H E

E L U T I E

F'

R T F: 0 0 t

·

l

13~-DE::

-. ,-. 1

t

·

1

H

T

R

I .

...

:

F E

t_.

E

.::·

I

K 0 L 0 1

·

1 :

n

;· .. ~

u

I-I)) ( j

z

LLI IX ÜJ û. 0 C H R 0

1·1 A

T 0

L

I

T

H E

ELUTIEPATROON

3H-DE:3

r-1AT

RI

X

: FECE:

::

n _.,. " LJ 1-(.1) (.9

z

LJJ ü:: C.ü

u..

0 60 R

4

~j 30 2 ~3 1 (1 13 61::)

A

50

40

30 20 1 0 0

-~

F-.

.

~;ERH 1

.-.

c..

-

1

-;-"}

=

= = -_j__ '

-9

1 0 1 1

1

2

'

1

3

1 4 1

5

F R A C

T

I

E

:::

[

111

l

J

-I I I ...l.... --'--1 13 14 15

FPACTIES CmlJ

: t I

-

-

- - - -

.

---,

-

- - - -

--

-

--

-

--

-

-lcHR~~;TO~~~HE

A60

-ELUTIEPFITROOH

3H-HEX

50

t-1FITRI

:

:{:

FECE~:; n

...

40 ,·, lJ ~- 3 0 (IJ ·~

z

w

20 Ct:: ÜJ û.. 0 10

--

-

-KOLOt·1:

₆₀

C

H

F~

0 t

·

1 Fl T 0 L I T H

E

A

ELUTIEPFITROOt-1

3H-HEX

50

t·1RT~:

I}{: FECES

n ₄₀ " ,.,

u

...

₃₀

(I) ë1 ... ._ w ₂₀ Ct:: û) û.. 0

₁₀

0 SE~:H - -- I

SEF.:H

1

.

c..

-,

3

-r-:1 I 1 I _ . I I • ..J--4 7 10 11 12 13 14 15

FF.:ACT

IE~;

Cm 1 J

( lt'i~uur

3

KOLOM:

60

C H

~:

0 1

·

1 R T 0 L I T H E R

ELUTIEPATROON

3H-OE

50 l"lRT~:

I X: FECES

.

L

.

_

n ~··.~

u

t)) ( j

z

w

ü: ÜJ ü..

·

=

·

4 (1

30

1

(1

KOLOI"l:

60

,

c

H R

o

1·1 R

r

o

L I T H E R

ELUTIEPRTROOH

3H-OE

50

1

·

1 R T R I

}{ :

F E

C

E

S

~ . 4(1 a·, u 1- 311 (IJ Cl

z

w

20 ü:: ÜJ u. 0 10

:

-

1

-. f-1

-t; E F~ H .t r ---I

-

I ~~ I 4 ~ b 7 ,- 1~

-

11 L ·~.. t L 7 .. 14 1.r= _.

F R A C

T

I E

S

[

rn

1

J ---~~~---~

MO !>O

io

\0

\

\

•

e-

--à;..,..sz.<:M.

~Q..

Q..,G..

0~ ~ ~~.

\;\:.o.

o~

~èQ:-:, ~-e. ~o-e)...

---

- - - 0

- C >

- 0 -' ~-- G ~~~02..·0\

b2

\..V\0'1::00:::::.:.:..).._ \._A.c'-"./'\ ~~ ' _..v~G..á 0~ ~ ~~2>--=-

...

~àv

...

-.a-'

.."

-~~s

_Pharmacia

Diagno

s

tics

Ç

\

8

.

:·

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 3 4 0~ I I 5 6 7 8 9 10 80

--.

8Q)

1

~ 70 ,_ ~

·-11 Cl. 60 \,._. w (9 50 <l:

1-z

40 w

u

0: w 30 0.. 20 ' 1 - - ·-- ~~· :rr ----~ , '1

I

I

I

.

_L

I:

I .

,·.,i

I:

I

;

! !.1 •!I i

i

I

I·

,.

!i .

1'.'

~

~rHHl

i

rr.

i

J-+-

+-

.

-

.

-1-~

-

~

11

1

i

.

t

Jll

'

l!''i

i

jl~

,

ill

l'll~~

!I

I

11:

J~l

i

jli!

.

-

~

f--

1

-

·

i

-

r

I

!'!I

RI~

dl

i.

i

r

~ I~

I

H

.

,

1 'I

lillil

I j_LL L - -· . . .

I~

l·~t

J~

jl~ljlll

fili

l

i

ll~

' i,- · '-f-- ,

!

~

IPI

hil

,H

J

illdii'Jrltl

llm

.

-

-

:

·

l_;::,_~e=

-

1

_

-

-

~i

J.

~!

l

ll!!l

J!J

l

flil!j!l

i

i

l!

..

lllifl

_

,_

-l·; , .

~.,

,tj;

,1

,

1

~

-w

~

•

l

ilt

!

_J

·

_.

.

_1~1-f

,_~

_--1--- _

r

l

1-

_

-

_I!

lf

}}i

_·

l

_:li

,:

_lij

tt-'

_.

Ut

_-

ti

_I~

·

111 _I :_l[i _"'l

l

il

·

!

_lj

·

11 . __ __ . - •- - •. lill 11' \H . ,·11 : 1.

- H· i·t t lf;U iJ!~ ti·

w

lU.; IJl

:jl!

!f"

•

1 , , , , 1-H 1++1-1 H+H f-'Y+H+I+I++I+IHHH+-H-I+I-I+HI++I4+1-1114f+l - • - .

r

-'--

~:t

w

r-

-

I

Jh+

1

:

nl·~--JI·

I

++i

H!

il::l.,,

:

~

!

I

rB

j·t±rfm

rt:l+

t

n-. I+ .

~

. . -· -· :-' - _

-

~_I±

. ..

!t

,:~

~

~-t

t.J ,

t!

:t

J~ll:

I , i I I i . : '

.

. I I I i I · · i

rr

~11 h"+ f'+++ 4-l • 1- - ~ • 1::1 j":::j:t"r· ~i- ~t .11 11 t tt~

-

tt " I f-1- 1N li+i · · · t - - ·1-"-'-1- . . . . · ,, , ,

l

-

''1

₁- ttr.,l"I I-1-H

~+=

1=!- 1t

~t

.

.

.

~-

~~

~=

.

~

-

±~-

~

.

~

rrl'

1

:

-

l

~

IH

..

i

ir

!'~

1

:

1

,

~~

--.

• t l _,~I 1-t• r,:;. j:::: i± . 1- I ·-'· - jl: I . J, 11 l-1 .. JI ' '

tlj

l

i

!i

l

i I

1

·l

·

H+l- rttt r.:;:; -

r

l+l±tt!:lt I · - · ï + I I 1 _{I 'ft ·!i I tij'}

'

I

_;lj'jjl'

1

0.

I .. · · 1.!.-=:-.. ::r,r 1-tj:~ · - .:i ~~~11ï-tl + - - - · · · .

rl

..

!==1=.1=~1= - :- -:1-1=~ 1·

!i

dl

i r 11-;: ! I rd~

f

f

litli

.1

Cl...l

IJ

tl

.

.

fÈ:J1hct . !i~ 1-+ ~llrl~Hijf! - . - .

u

...

,:::::r=r=

-

=

- -

.

-·.

1::1:

"

li

I! '"

ljiJ-lli I! jl:i ;IIIIJ!. !;l! ~

·I . .; ·--d"TI+ lt f1:1j.t ·1- . , - - ~t lt , lil! 1-ltllj ., ,ltt .1Jt t~•i• _

11 ti-.I ! ::::. Ï 1! :: I l i :.• .,; r:·H': ,~1~11 :..t U ~ li-i+ll!lf1 ~rt! t .;i~J· lil'f-r::: -1-·r:::~-,-- _1- · -. - · · - . · ~ -=:±=I= ~:.:f--_ 1::1H-:: ·_ . I 1:1,_ ~· I rilt il ~ 11 li 1 !

•j:;

j • • I J ~ j j j1iJ 1 : !-f!;lt 1: Jl! lil: '! l' .11. : :: l .:::: 11

:!11111

l~:f~1

..

!1ll"

1'".! • .

1

'

:-tt

·

,

rr1Jt::'

~IIW1-=I=t::-::t=t-

_

_-

·

t=---i.=: ~==T -~-=

....

:iJ-~.

L!

l

t

!t!Jî

l'!l

:::

tït'

ll

lUI!!t!tlli

;i

!

!

-·. i· 1 .. :t•H• • · ,fi:::i:.,l- • ltl - - - 1':-'---=L -·+---+Jr-- . i 11! .1. , . . ,:111• ·li•lltl· .... \..._

j· : ., :

l[j

jl!i

l

11 ;:J·:I_L+;1 :~HI'!l-l-!- li ·

.

lfl!!

-

l·=b-:+:t=- - .-.. - .. . : ~-! . _.

I!

r·:::..:0t·-=- :~~~.;-_-=l-

-

:lll

l

tj

1

1!1!Jl:

i

:!i11!:!1 ili

l

ll

:l!

:'Jllll!llq;;

· I · · • :I .I Llf-1 Y.l1 ~t- IÇ .· ~(m- 1+1 t- + - l's:. -1r -T- :-tl l.t• 'll ··lf!l ·'I• ·, ~ !Jîj !!HH!!l 1...

t

I : _I ! . 1 ! I

i

1

i

1

I

t

!

ll

ll

i

:::

"I'

·

!

·

I

T!i11

' I

ffl

"1

t

,,

!t:!

r:,

l

il{

-I . ·I

li

l

, ;;I' .. , --'=f':::--.t1-:-!-,.:_ 1- .. --- ... , •

I

·t ' - -

~

1

-

'

~

---

1.-

_

~-

j

~

- -

-

!'-~

.

--

.

,

i

.

+

!

·,

~

I I 1!1'1

'

"

':

!i'

;j"l'

' I

lli!:

I ,, :I

'11

I

1~

i

l

ll

l

l

i:l'll'i

ll I' (9

• 1 ~ r • ' 11 1n • 1 • I - - · · 1 I - ·- • - J I 11 1 •' • 1 I Q

:,~(

~

,,,,l!::!:

::

~·:!'ii:,i!

li

ll

t~

~

'!lli

l!

ll:l

:::.:.

:

=·:.=.:···

___

-- ,._ I - J

~~

!n~~~~~~

~

--J -

I

,

Ll

-

!~

u

_

_

'ullu''I!!~·~~M

·

··I,i'''''

'

''lllll''!l:

_J

· : il 1

•••• 11·•1!1 .ll

1

il

1

lfiilt ·li!it!ll - t-·ï-=-- - - - · :f:t-t

1

·

lî '11 :1 -1 ---Ï

l

'

t--J

11 ~bi>

:.i.LL!J*

I

i

r·l

·

'j I

I'IIIIJ

'

ij::

. _{1 1}

1

~.,i,

....

.

q.,,-~.~~ ,.~ ,m~lt~lr'':l~--f---l---~-

-

IH-I! J , - H~

11

.- ~i

_

__ ,

-111

_~ ïwrrm~

₁

.

₁

,~

1

,1,'j1!

1

1_llllli·

1

,1. I . I! ... , ·l,·t+·w-t r' , ,, - : -:· -1- . . . · tt11t u . - --~ -. , . I ,. 1: . ' I, ... '

111

1

I

!

IIJ1:

:

·

::~,,

11~1

--1

r

·

1r

~

,,

lt

:

:

ilt

·=t=

F

_I

I -

f:trl-tHI

·

H

I

~

.

I r H

r

.

l!~=-~t,~

.

-1

-·

i

,.,

.J

,

.

,

,

J

.ih;

lll

:il

liiii:ii

:

,::

' i

I

' 1 ' I !

:!

l j i 1

!

1

:::i!:J!Jli.lli

~~~~~

11"!

11

l

!ll'~

=0-~=-

l

.

'

~

~- _

j:fl+

·-

11

~

.

H

l

lt

ll

~-

1-:,~

-1-

l-'

-1

1

1

1

l

j

+

~

~~~~w~~l

1

!i

1

ii

tif,1

1

'

:~:!:!!1ilf!!

1

:

!

ll;

!!,

I

..

,

~

i

i

-"!li~illl!lni·

!lf

l

i

:![

,

'

!''

:

I--

--

~

~

-

'

Ir

---

il

l

t

I

-1---

i

.

,i

~~~

~1

\

rn~~~J~

·

nJ

~

i

i·

iid

:··

~~

• 1

'i!

j'

'

l!

l

!il

1

·:i

!·~

ij1

1

.. .

1''

11

.

!

.i

jll

'1

1

-

~---

-

J

·

t

--

.·

·

j

-

-

I

----

1

~11

1

----

lij

!

jJ!! :1

jîr''

.

in

l

'

lll

i

ii

'J

~-,

..

.

1 ..

• I

I

.

I I 'I • dl'. I I I J I' ·1'1 . I., t- -· - - . -

I

-

I .

.

;

I

I

.,

,

I

li~'f" !

'I

liJ,!! l l·1Jll

I . . !

I

I J.::i ,j::ll I

IJ

:

H·

:

·

----•,---

-

-·

.

.

.

!1 . . . •

<

1,.11 I ·i' ·"~

I 1 ; : ·

1

~,

i

!i:

--·-j·

::\hll

!

i

i

H!Ii

,

lh::liï

;

:

----l

---

I

1

-

1

illiii!I-J ,

~

~~

~

!

i

!lr~~

i

ll

!:

1

:ll

li

l

l

:l

.1i

~'ll

~-,

.

·

IO

I

I

I i I

I

I I.

'

I I I '

'

I

I

' .

. " I

i

'

l!

'::

!i·

·.1'

:

'

i

J:

Jl .,

I ':

,

ril

.

I

'I'';J

I' ...

'

Jll

:.·

[

.

I

ll'

11

t

1!1

.,,

I

I

I

Jl . ., . ' ! I I

1'11

1:::;

"'I'

(I

I: ..

I

''I

! : :

ld,

':i'l

!"

·I'~,,

···

:

I

I

I

i! I

I

'

I

I;" ::;.· !11)

;i!

i

!

,

,i

'

·ll

i

lij

'

:

:

11 '

-

I .

I

I

'

i

~

JI

I

·

I!

:

I

I ,

,,

ltli·:)

'

i

i

!

I.

:

:i

;

11';

l

j

'

i'tl-1 : , / • I ...

·

i

:.,,,

:Ij'·

I·

I

I

til

ij

'

d-

-

•lil

I I

I

I

I

I

l

·

ii

...

11

!

I

,

.

,

I

:

lli''tl

'

l;·

•I•; j;::' I··:·

• ; I • I I • I I I I . I I • I. I ~ I I •• • I • I

I

·i

..

. :.

.

...

..

,

....

.

.

:JI ·•1: :.'-:'·

·i·

l

I

!

i I

I

,~.

I

I

,,

,.,,l,.j''t. . I

I

I! ::: ,, "''

j

:;

i;l

!I~·

I·;: ï ' . . : •.•.•.

I

I

I . ,, I I I I I 11

'

i

' ''

11

I

I I I I I . • • ' . .. I I

5 I r • , 1 ' 1 i I . • , '' ' I I "I I I 1 ,. , I I I · ' I I: • 1.' 1· •·

2 3 4 5 ·3 7 8 9 10 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 3 4 5 6 7 8 9 10

:!:) ::;, _J I 1-(.::l 0 ....J "' D

..

L -... ~

..

..

LOGIT "' c: Î ....

..

.

I •• :3 i > •-::: "' ó N N 0 z ï

I

~

' i .. __ .

9l0ZIPN"lr.;> [ _

-~

--

~-

-

:l!:

l~

!

..

---

..

.

·

·

·

-Ç"t

-::

l

_I

o·E ----::w.HIIIII!!II!IIIItllilll!' 11 !I!

ç·z o·r ç "[

t!

l

MIIl!

I O't S't l 6 11 I. 9 <: I• r.

H3

d

\fd

80

l-ll80

l

-

·

-

-.. .

.

. .

..

.

-

..

..

.

..

.

.

- .I

::11Ap~uv . . . ~ .

--

··--. . . -·.. ...

-

·

-i11-

l['lti

!

Îilr

~~~

i

~~

·

nrr

~

lltrrr

--

IPI

-

-~

rr-l

~~~~~~TI

'

ill

lil

~

1-

..

·

i

·

'-

-u-

+

11

'i

!li

'IJ

l

-

-

~~~~

~

N ~

~

~

·J

'-

-

--

,,,11!1

1

1'

!

!

ij

1j

-

l.

m

:

I " •

.

.

-

·

-

I_

.

Ll_

,t_li

!Hl~

.l.t

.

.

-

j

4

-

~

~

'

1

'

]

·

r

_~

i

11

~

~

~

,

~

1,

J _11

!

l:,

J

,

I ' I

l

I I

I Ij

~,

.

.

Wl

!

'

Jl

i

!I!

!tlll

I

ttt

~

~I!

1

1

f

l,

I

I

~

I

'

I'

I

I

I

I'

·

l

!

!

I

!

I

t

r

t·

+i+

!=

1

:

lllli

I~'

I

t '

i

T

,,lliiJil

ëf

-

-

1

Î-

c -

-

f-~

I

"i

iJ

l

h

n

h

r

t

'

t

~i

f.

im

-

l

I

.

.

1

-

t

-

-

~

~

1

·

-:

~

=Lill

Jl'

..

r.

.

'

-+

ll

!j!H

I

·.

·

I

.

~

.

:

h;~·=I~

·

Ji

:_.!

1

-1

·

I

'l!

~W

jjt

(

ltt

-

ttH~

I ;

~

-

~

-

~

~

l.

.

i

-

L

'

l

l

.

.

r~

11

dt !

l

,"~

I - J

*--'-

-

r-

-1\

~

1

! fi

t

-

.,:

t'~

4

+

tt

+

r,

~ttt

.

t..LI 1 ~-~ii 1

--t

·r+

·,

li~ l il

rr

·

·i

1-,-+-f-

-n

1

•

i!

n

1

d

!

tt

rH-

.

1

++-H

:

·

1!

·

:

~=~

~

:

~~-:.::-

B

l!!

IJ~ ~

n

~

uft

'

1

'

"'"

u'.

!l!I

+H

_

i

-.J

1

·

nJi

U

-

rt~~tc.

.

:_

='l;"

t

Jf;

t

·

lfU

!

·

H

+

f

t

~lt

·

'·

~

.-t::j:

r

~j-rW

·

·

01

~r~~~q;:#

~

;~~i

t

,

,ttl'iL,:~-lt

l

l

·

t

n

r.

,

· ·:

l

)lf!·

~,

..

~

~~

~ü,_,

,

:-~,:

~

lft'"

·~

·

t.JI_

ç;~~~:t

!

I

H

lti~ ~~\

!

lH~~~

ll

·

..

$F

IWtJR~

~

l·j1

·

+.

+tr

-T;l

..

.

1:'

=

~

-

-:::f-::~

~F-1.~

t j

1Jt11:

1

1·

J! J

D

--

.

~!lj!ilii

+'lt

lJ

i

t

:+!

Tf

.:

.f=f.

~

:

.

illiWlill!

·

lt

t

l

R:t

~

Ui

l#l

t

l

1t

·

·'

ri-t

-

~~

·

·

j

::•-::

~

:

t:::~=~-_:iU~H1i'

~

1

_!m;t

_~

_·

_-

_rf

_;

_{.; t}

_f!.l

_·~~l

_rtfT,.

_{·Tf ·}

_:H

_{_}

_riJI$t~:t:::

_,

_(Hi

_i't:li

₁

_'!lj'

_!

_Ji

_i~

_·:

_!~~n±~-t~

_·

_J

_!lU~~u

_t

_tt=bJ

₊

_!:

_:.;.

_-

_.Ei.$R.$.EE

_~

_~

~

::r::T.:t·=t:

-p.--=f;

.i1-=fA

lh

:~:i,

..

~l~1tlli

).

~

-H=

-

:..;J,:

I

u!l+h1lij

hi1Jt

ft

'

~=~

:

tJ

·

:

'

.

1

~~+:=:;fJ

~l

~îf

.~l!

-i-t

n

#1t±

0If}i

#·

1:

I

r:~~~-~;+ -~:.-=::-t::t=--

;:;

0

f.'~ ~

,

~~~~~~u

~

:~wr

~

₁

1

_hlhui·

_t

_·

_-~

_~~:

_·u

_~~

_'~

_l!J·rr

_~,~

₄

_~

_-

_i

=tttt··t:

~~~

-

-

d~~

-

~:(

~

i

~:~·~

~~'!;t

1

.m~H~:~l#

q~

;

~

~~~1ftlli·~

-

~~

~

~l!~

:

~~r

t1:ft

:

~

:

~

-

b=

0(

~

:

.:..-:.

1

:;:.~

_

,_

..

~-

-

; :::n·

nPr.l·

~·~:ljl:rt

·

:l

:.,_i\·

-·11-1

~

..

!Ht:..

_

..

·

·

i

f:rt=ft;.

·

~F==-1

::

-~

;

i

i

·

H

trll~

-

'

fH

I

~

=rtJ:JfHI

'

~

·;t§·,~

-

-~-_,1:,·,;.~:::E_-

~

-t.

"

f.Wr;

·

'

..:..~~~~o,:a. '1· .

t

*

J

I

..Lr

f

!'

.

-~-

.

-

"'~· = .,

l-:::.::1·=-

.".

lm

H

,

'

-

=~:r#i -.~.

tf.i...::

~ ;..:::.:.,=r~-.:r::~= ==~ o• -1

.

1

îJ

''

r

~:!:~g-4t.:.

lt.:,

=_

,

f:'hJ:

.

~

~~j

·

-

!,

ll

(lil!.l!j1'~,

~

.i.,'Lt8.

'l,

.

i

lrr

,

·,~

)

/.

l

-

:bL

~~

L:

,

:

,

~

.ill

:

~(j·~-

J

t

I·

Hm,

!!JuJ..t

'

.LD

,

;

.

J

·

'

:

..

'

1

:

,

/

•

llj~

• -l·J..i

: -~

.

J$.)

~t;tJ~~!

:~

:..:.

\%!IT

!,!,~I

,Ht

ll,

j J j- .1.

r~

f.f

-.:

·.:0:"1

·m

~

.!".:L

'

~Wtf.

t:r}

u1t]hk

md

·

..

Ft~~~rp:J~

-t1:EJJ:...[:C.1 · .=E=•:-t

.

:

~

=

-

~

= o;

~

:-.

~~

;gËt

=

-

~

..

d

~t

ll

}i.,

=iJ~lÎ.-=-

:

...

=

{~lm1L1+rä

-

i

.

~'

..

<p~"$K

•

...:

'd:::::\

==l'

i

'

itH-

l

l! .

I>~~-

_

J.)w~

.

-

~

-

~~~;

~

-

rt±

-

~~~

g_

.

o _._- ··~·--·J::: _l!lrjpi~(H-

" '

.

_.f. -~· .1:!-,JilJ

rr

i

,

J.I

.

.

,

,

·

..

'[·tJ;.:!..~ ~-="':.-~I lt . : . _'~"" ,fE'j[ ·:::::::- . ~-:·.,:: .

09

:;

·

:.dJ::='.-:l~~a:~I[U'I{.B 1J:!J1UJ~ _.-t.

!

t

·

li·l

1

J

.

.

·

!

_-

1

-lj~ ,=:-~ -~== ~~~ . . : , .. ~-TI :~1 ~+!0 =~="-=~=-Yr.f-:==~ co -~ --·~ !=_:t· ~E

$,"!

·

'

u

r

~$.) ~

r -

t

u

·

'I~~

.

.

t

-t

I-"~=· ~~ . . . ~

*

!:;.~ -. - .

~--i~;~t~t

~B~~~:,l'!

f

t{i\,111;

.

1

1

_·rü

_·

_:.

_~JB~

_,

_:Î:l

_lrHlrj~i-

_ll"n

_'·--,;

_~I:

_"

_LJ)-l

_l'4~

_--

_·

_;

_~--

1

I

~ittjt

·

...

t;,

=

~

'!;

t!

~-

:

~

.

:

~r

;:

E

i

r.

-

OI

!D

1

ro

~r,:"

'

l'~[~!

Hffi~ H,-

r

~

t

r

t

..

~

;f j.

B

f:if-,

i

'Tl : . .

J.f·

J

=

~:=

'-::;~

;

i,

.

rfl : .

:!'

~

·II

~~

'I:::.

:

·-

::

1,:0

>+=~

!,r,-

~1~,~,

·

f.tf

l~~~~

·

·Q

:

:(@

~

-

,,:

[l

i·

f~

-:·ff

W

.

~tf~

~~;

!r'

~tlrtl

t

~

..

-

~

-

_.

~

.

~~~

~~

-

~~

09

~

~

r-~~~~

·

-

~

·~o

~~~

~1lJr

'

~

jri

8

_J

1

_~t;::j

1

L

f

rr~},ll

1

_1J1

_·

_#J~~

_~

1

_~

_~

_r;:

_{_}

_l

_~

_~~~

_m~!

_J

_l

_{· ·}

_·

_·

_~=··

_.

·

·

'

i:t

+tl

:-

-:

!P'·

·:~

.

.

~I!

~!I

+cl

w

+

:J~-Ul-

j_jJ

i

!

l:r

:-'

-:~

'

.

1

1

~

.

:

ll

·

.

I!

.

-

'

''i1lt

~~l-

0

.

·:

1-

:i

=

1

1

:

3l~

!

'flil

~

'-r

1

-

~

~~~

1

~~

:

·

:

1

'J'l!'

1

l

!

-'.-~-l-~

J

tt

t.

~Ë~~

=

~

l

l''

1

~

~

·

1]

1

.L_: .. :

1

1

_Jt

~

f

_{_}

~-

j

~rn-

,

,

t

t

-~

·

-

t..

.

)1

i

.

Hjl'!l

i1

I

·' . .

.

.

iî

I . -

--1

-

+

- -

.

-r-·;t

I

.

-

t

.

'i+H-+ ,.-

rw

llldillU

ÏI"

.

I

i

~~

.

11

.

ç6

-+1-\~

'

--··j

'

.llllllllli,IJI

,~'

l

i·J

I

·r

'r

~il

'I

-'ti

+~

·

-

,

-

--

11

t

.

·

!I

~~'

i

!

,

'

"

~ ~

-

-

.IIJ,.~ft1

,

!

ilji

'

l

'

~.lill

j

.

ll

1

1t

l

l

1ljj-

-

-

-

j

'

il

.

.

.

.

1!11

I.

i

..

!

1

,

·

j'l'l

'!lliw

l

₁

i

[

I

₁

J

,

:J!1!

j;!il

1

Ij

l'

1

11

I

lill

l

UillJ

-~ ~

~.ÜJ

Hl

.l

.rJb

J

_

_

rJr

1_,

I

J

.IL

l

lJ.IJ.

,

j_

Jl

lL_.

_I

~

I

J

l

I I I l I 66

C.: 1 t> :r t_ !' c-; !: :-: ~. ;.; l (, H L 9 f, :, r:

5 "()\:).,

.1...\0

~

ó>

\

~

\

0 ?>0

_I

,

,

I

O

I

\

I

I

I

"

I

~

~

9..0

•

\0 0 \ u

\

₀

',

_' lt \ " , "

~

'~

'

_'

_...

--.

~--~'

~ 0~

c

~

~

..Q.x..M

<

~

c

,À

.

~\o. o~

\_( ... ç_v-;,

~-~<.:..

,z.A ..

'v-o-~.