Rapport 89.38 Juli 1989 Inventarisatie van de mogelijkheden van het gebruik van N~1R technieken binnen het onderzoek van DLO, en een voorstel om te komen tot het instellen van een faciliteit
H.C.\.J. Donker
Goedgekeurd door: dr F.A. Huf
Rijks-K,o,raliteitsinstituut voor land- en tuinbom-1produkten (RIKILT) Bornsesteeg 45, 6708 PD Wageningen
Postbus 230, 6700 AE Wageningen Telefoon 08370-19110
Telex 75180 RIKIL Telefax 08370-17717
Overname van de inhoud is toegestaan mits duidelijke bronvermelding.
VERZENDLIJST
INTERN: Directeur Sectorhoofden
Afd. Algemene Chemie (2x) Circulatie
EXTERN:
Dienst Landbom>~kundig Onderzoek, ir M. Heuver en dr J.J. Dekkers Lm~. Vakgroep Moleculaire Fysica
LUH, Vakgroep Biochemie
LUH, Vakgroep Toxicologie, prof. dr J.H. Koeman RUU, Vakgroep Organische Chemie, dr M.J.A. de Bie
ABSTRACT
Inventarisatie van de mogelijkheden van het gebruik van N~ffi technieken binnen het onderzoek van DLO, en een voorstel om te komen tot het in-stellen van een faciliteit
Investigation of the possible applications of using N~ in the research programs of the DLO institutes.
Report 89.38 July 1989
H.C. \J. Donker
State Institute for Quality control of Agricultural Products (RIKILT) PO Box 230, 6700 AE Wageningen, the Netherlands
6 references, 1 annex
In order to come to the use of N~ techniques the research programs of the DLO institutes are investigated. Two central themes for the use of N~ techniques are found, carbohydrates and nitrogen metabo-lisms. A proposal is made to buy equipment.
INHOUD blz ABSTRACT 1 INHOUD 3 SAMENVATTING 5 1 INLEIDING 7 2 N~ffi SPECTROSCOPIE 7
2.1 Beknopte fysische achtergrond van N~ffi 7 2 . 2 l'lee tme thoden voor N~ffi 9 2.3 Gevoeligheid en resolutie van N~ffi 10
3 ONDERZOEKSVRAGEN BINNEN DLO IN RELATIE TOT NÏ'ffi 12
3.1 Inventarisatie 12 3.2 Centrale thema's 15 4 NÏ'ffi EN ORGANISATIENIVEAUS 4.1 Moleculair niveau 4.2 Cellulair niveau 4.3 Orgaan 4.4 Individu 4. 5 Populatie 4.6 Bodemonderzoek 5 APPARATUUR EN INFRASTRUKTUUR 5.1 Apparatuur 5.2 Infrastructuur 6 CONCLUSIES/AANBEVELING LITERATUUR BIJLAGEN A GESPREKSPARTNERS 17 18 19 20 21 22 22 23 24 25 27 29
SMfENV ATTING
Uit een eerste inventarisatie van de mogelijke toepassingen van NMR technieken ten behoeve van het onderzoek van DLO blijkt dat N~ffi een grote bijdrage kan leveren aan allerlei onderzoeken. Met N~ffi technie-ken kunnen waarschijnlijk hoogwaardige kwaliteitsparameters gedefi-nieerd '"orden voor verschillende grondsoorten, land-en tuinbouwproduk-ten en andere levende onderzoeksobjecten in bodem en water.
Twee centrale onderzoeksthema's, koolhydraten inclusief afgeleide koolhydraat-verbindingen en stikstof huishoudingen tekenden zich af. Binnen het onderzoek is ZO\olel behoefte aan hoge-resolutie
mrn
spectroscopie als aan afbeeldende N~ffi. Voorgesteld \•lordt om te komen tot de realisatie van een N~ffi faciliteit die in staat is beide soorten experimenten optimaal te verrichten. Gesuggereerd wordt om bij de realisering van een dergelijke faciliteit tot afstemming met de LUH te komen. De voorwaarden voor het optimaal functioneren van een derge lij-ke faciliteit worden vermeld.
1 INLEIDING
Aan het eind van de zestiger jaren begon de ontwikkeling van het
gebruik van kern-spin-resonantie technieken met spectroscopische toepassingen binnen de researchchemie. Het aantal toepassingen van
N~1R technieken nam hand-over-hand toe. Tegem10ordig is N~1R een
tech-niek die op velerlei terreinen toepassingen vindt.
In deze nota zal nader ingegaan \•lorden op de mogelijkheden van het
gebruik van N~1R binnen het onderzoek van DLO. Na een aanvankelijke N~1R aanvraag voor het RIKILT ,.,orden nu de mogelijkheden voor het
gebruik van N~1R technieken in DLO verband bekeken.
2 NMR SPECTROSCOPIE
2.1 Beknopte fysische achtergrond van NMR
Atoomkernen bezitten een kernspin. Deze kernspin is aanleiding tot de vorming van energieniveaus wanneer de kern in een magneetveld wordt
gebracht. Kernen met een kernspin van een half vormen twee energieni-veaus. Het energie verschil tussen deze twee niveaus zal groter worden naar mate dit magneetveld sterker is. Belangrijke atomen met een
kern-spin van een half zijn lH, l3C, 15N, 19F en 31P.
Maar ook andere kernen dienen niet op voorhand uitgesloten te worden.
Het lokale magneetveld dat een kern waarneemt wordt bepaald door het externe magneetveld en door de elektronenwolk die zich om deze speci-fieke kern heen bevindt. Dit lokale magneetveld is meestal
verschil-lend voor elk atoom van een element in een molecuul. Deze verschillen in het lokale magneetveld, zoals door een kern waargenomen wordt,
komen tot uitdrukking in zeer kleine energieverschillen tussen beide
niveaus van een element op verschillende plaatsen in een molecuul
(chemische verschuiving).
Het energieverschil tussen de twee niveaus van een kern wordt gemeten
door deze kern te bestralen met radiogolven waarvan de golflengte overeen komt met het energieverschil tussen de twee niveaus. Dit is de resonantiefrequentie.
Indien het extern aangelegde magneetveld constant wordt verondersteld zijn relatief grote verschillen in resonantiefrequenties een gevolg van het observeren van verschillende elmenten. Kleine verschillen in resonantiefrequenties zijn een gevolg van verschillende lokale mag-neetvelden voor verschillend gelokaliseerde atomen van een element. Propaan bezit dus twee soorten protonen en twee soorten koolstof atomen die allen een verschillende resonantiefrequentie hebben. Hier-door zijn ze te herkennen en dus te onderscheiden van elkaar. De reso-nantiefrequentie van koolstof is 25% van die van waterstof, terwijl het verschil in resonantiefrequentie tussen twee waterstofatomen of twee koolstof atomen niet meer dan 10 tot 100 ppm is.
In een NHR spectrum moeten de \•Taargenomen resonantiesignalen altijd aan een kern toegekend worden. Soms is dit triviaal, in andere geval-len extreem gecompliceerd. Dit is het toekenningsprobleem.
Tevens blijkt het dat twee kernen met elkaar kunnen koppelen waardoor hun beide resonantie signalen opgesplitst worden. Kernen met een spin
van een half moeten vergeleken worden met kleine magneetjes die in
staat zijn elkaar te "orienteren''. Deze koppeling kan rechtstreeks
door de ruimte of via een of meer chemische bindingen verlopen
(J-koppeling). De j-koppeling bevat informatie over bindingshoeken, het
aantal koppelende kernen en ruimtelijke afstanden tussen twee kernen.
Nu de atoomkernen in een magneetveld zijn gebracht waardoor er twee energie niveaus zijn verkregen is het niet alleen mogelijk om naar de
resonantiefrequentie van de betrokken atomen te kijken, ook kan
geke-ken \oTorden naar de snelheid waarmee de evemo1ichtssituatie wordt
her-steld vanuit de resonerende toestand (relaxatie). Er zijn twee soorten
relaxatie te onderscheiden, Tl en T2. Tl relaxatie leidt tot het
her-stel van de verdeling over de energieniveaus en T2 relaxatie is het verlies van fasecoherentie van het resonerende systeem. Deze relaxatie
snelheden zeggen iets over de manier waarop een atoomkern zijn
magne-tisatie over kan dragen aan zijn dirakte omgeving in het monster. Dit kan op meerdere manieren gebeuren. De manier waarop deze overdracht plaatsvindt geeft informatie over de matrix waarin een kern zich be -vindt.
2. 2 Heetmethoden van N~1R
N~1R ,.,erd aanvankelijk ont,.,ikkeld en toegepast als een niem-1e
spectro-scopische techniek om "continuous ,.,ave" spectra te verkrijgen van kleine moleculen. Het behulp van een set referentie spectra konden nieuwe preparaten geidentificeerd worden. Binnen het meetbereik werd
sequentieel elke golflengte in resonantie gebracht waarna de adsorptie van die golflengte gemeten ,.,erd. Typisch voor deze apparatuur ,.,as het
z,.,akke magneet veld, minder dan 100 Hhz voor protonen, en de lage resolutie. Daarom '''ordt deze relatief goedkope N~1R toepassing ook ,.,el
c.,.,. of l.r. N~1R genoemd.
De behoefte aan meer resolutie nam toe omdat het molecuul gewicht van de interessante moleculen toenam. Door gebruik te gaan maken van
cryogene supergeleidende magneten ,.,erd het mogelijk de resonantiefre-quentie van protonen omhoog te brengen naar 600 Hhz. Omdat nu ook het bereik van de spectrometers toe nam ,.,erd omgeschakeld op puls N~1R.
In tegenstelling tot continuous wave technieken worden nu alle kernen binnen het geselecteerde meetbereik tegelijk in resonantie gebracht met een electro-magnetische puls. Het terugvallen van het signaal naar de evem.,ichtstoestand ,.,ordt geregistreerd als functie van de tijd
(f .i.d. of free induction decay). Door middel van een Fouriertrans-formatie wordt uit dit signaal in het tijdsdomein een
resonantie-fre-quentie-spectrum in het frequentiedomein verkregen.
Deze N~1R techniek '''ordt hoge-resolutie N~1R genoemd (h. r. NHR).
Op h.r.N~1R apparatuur wordt doorgaans correlatie-spectroscopie
bedre-ven. In een gecorreleerd spectrum staan langs t,.,ee assen N~1R parame-ters. In een dergelijk spectrum geven de signalen aan welke s pectro-scopische informatie elementen langs de x- en de y-as met elkaar ge-correleerd zijn. De intensiteit van een dergelijk signaal zegt b.v.
iets over de ruimtelijke afstand tussen twee atomen.
Tegem.,oordig is het ook al mogelijk gebleken correlatie spectroscopie te bedrijven met drie assen. Door meerdere correlatiespectra van een molecuul op te nemen is het toekenningsprobleem vaak te ondervangen. De monsters die voor lage- en hoge-resolutie N~1R spectroscopie
ge-bruikt worden zijn homogeen-opgeloste zuivere chemische preparaten.
Het bleek ook mogelijk N~1R te bedrijven aan vaste stoffen, georien
Voor het meten aan vaste stoffen dient het monster zeer snel geroteerd te worden onder een unieke hoek ten opzichte van het magneetveld
(magie angle spinning). Dit roteren vormt voor het monster een enorme
mechanische belasting. Tijdens het roteren mag het monster niet
oot-mengen, vervormen of luchtbellen trekken. Hierdoor wordt de
monster-vrijheid behoorlijk beperkt.
Door geen homogeen magneetveld maar een lineair gradient veld aan te
leggen wordt het mogelijk om de resonantiefrequentie van een atoom
te correleren aan de positie van dat atoom in een monster. Zodoende
is het mogelijk ruimtelijke verdelingen van moleculen waar te nemen.
Naast gewone dichtheids-verdelingen van moleculen (imaging) is het
ook mogelijk gebleken verdelingen te maken van het relaxatiegedrag van verschillende kernen of kernen met een specifieke chemische ver-schuiving. Door vervolgens een "volume of interest" aan te '"ijzen
kan een spectrum verkregen worden van dit volume: lokale
spectro-scopie, zodat, non- invasief, spectrale informatie gekoppeld kan ,.,orden
aan de verdeling over een monster.
De keuze van de veldsterkte van het magneetveld, '"aarmee afbeeldende
NHR bedreven '•Tordt, '"ordt bepaald door het onderzoeksprobleem. Soms
is het nodig op een laag-veld magneet te werken omdat het monster
sterke gradient velden vormt in een hoog-veld magneet.
2.3 Gevoeligheid en resolutie van NHR
De gevoeligheid die met NHR gerealiseerd kan ,.,orden hangt van een
aantal factoren af.
De mate van natuurlijk voorkomen en de gyromagnetische verhouding
bepalen in grote mate de detecteerbaarheld van een kern. Indien de te
observeren kern een laag natuurlijk voorkomen heeft kan verrijking
uitkomst bieden. Verrijking heeft het voordeel dat een zeer specifieke
component bestudeerd kan worden. In een levend organisme kan deze
com-ponent de voeding zijn voor een metabolisch proces.
In mindere mate wordt de gevoeligheid bepaald door het spin-quantum
-getal. Indien dit getal hoger dan een half is onstaan er meer dan twee niveaus. Hierdoor zal de intensiteit van een signaal afnemen.
Vaak is het mogelijk de gevoeligheid in een experiment te verhogen
verhouding zal hierdoor met een factor \•Tortel 2 toenemen per verdubbe-ling van het aantal opgetelde F.I .D. 's. Deze gewenste toename van de gevoeligheid \o,7ordt altijd afge\.,ogen tegen de toename van de tijdsduur van een experiment. Tussen twee F.I.D. 's dient altijd voldoende tijd aam1ezig te zijn om het monster volledig te laten relaxeren. In ex-treme gevallen kan deze relaxatie tijd redelijk oplopen (1 min. b.v.). Indien kwantitatieve resultaten verkregen moeten worden is volledige relaxatie tussen de F.I.D. 's noodzakelijk.
De aam1ezigheid van paramagnetische elementen dient uitgesloten te \.,orden omdat zij een enorm relaxerend effect op het NHR signaal heb-ben. Hierdoor gaat vaak het totale spectrum verloren.
De resolutie wordt bepaald door de sterkte en homogeniteit van het externe magneet veld. Wanneer het veld in sterkte toeneemt zullen de resonantiefrequenties verder uit elkaar komen te liggen waardoor sig-nalen beter van elkaar te scheiden zullen zijn. Indien het magneetveld niet voldoende homogeen is zal er lijnverbreding optreden, met verlies van resolutie als gevolg. De gewenste resolutie dient getoetst te \.,orden aan de taak van een NMR spectrometer.
Dit zijn de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de gevoe-ligheid en de resolutie van een N~ffi experiment. Zij kunnen per experi-ment verschillen. Het is daarom moeilijk een minimale concentratie aan te geven. Om toch een indicatie te hebben dient gedacht te worden aan een ondergrens van 0.1 mH. voor een h.r. N~ffi spectrometer \.,aarop correlatie-spectroscopie bedreven wordt.
Voor een imager \.,ordt de maximale resolutie gegeven door de omvang van het monster en de vulfactor van de zend/ontvangst spoel. Binnen deze spoel kan maximaal een beeld verkregen worden van 256*256
pixels. Bij zeer kleine monsters wordt de ondergrens bepaald door de "self-diffusion" van de te observeren kern. Deze beperking \o,70rdt erva-ren bij monsters waarvoor de pixel afmetingen kleiner worden dan 50*50 um. Bij deze afmetingen van het monster gaat ook de minimale dikte van de afgebeelde laag van het monster een beperking vormen. Contouren vervagen als gevolg van de dikte van de laag ten opzichte van de gewenste resolutie.
3 ONDERZOEKSVRAGEN BINNEN DLO IN RELATIE TOT NMR
3.1 Inventarisatie
Om tot deze inventarisatie te komen \olerd overlegd met de diverse DLO instituten en de Lrn~. Na een samenkomst van een afvaardiging van de
onderstaande instituten werd per instituut gekeken naar mogelijke
toe-passingen van N~ffi technieken binnen het werk van het betreffende in-stituut. Het CDI, IPO, RIN, RIVO en RIVRO zien vooralsnog geen toepas-singen voor het gebruik van NMR technieken binnen hun onderzoek. Hier
volgt een opsomming van de onderzoeksvragen zoals die bij de betrokken
instituten werden aangetroffen.
ATO
Binnen het ATO gaat de belangstelling uit naar kwaliteitsparameters
voor verschillende land- en tuinbom-T produkten. Is op voorhand vast
te stellen wat de levensverwachting van een produkt, al dan niet in
een verpakking, zal zijn en hoe deze te verlengen is? Bekende
voor-beelden hiervoor zijn de stevigheid van een tomaat of de meligheid van
een appel. Maar ook liggen er toepassingen binnen de sierteelt van
planten en bloemen. Waar stagneert het transport van water in een
stengel van een snijbloem zodat deze verschrompeld en wat is het
metabolisme wat hier aan ten grondslag ligt?
De behoefte van het ATO aan NMR technieken richt zich op deze
k\olali-teitsparameters en het achterliggende metabolisme.
CABO
Het CABO is er op gericht inzicht te verkrijgen in het functioneren
van de plant in zijn omgeving om te komen tot een hoog\olaardiger
land-bouwprodukt en produktie proces. Hiervoor is het nodig om de '"a ter
-huishouding en het metabolisme van een plant te kunnen observeren. Een
voorbeeld is het rijpingsproces van veldbonen. In de laatste fase van
hun ontwikkeling moeten de vruchten van de veldboon snel hun water
afstaan om kieming van de zaden te voorkomen. Van dit
uitdrogingspro-ces is geen mechanisme bekend. Het zou kunnen zijn dat het Ca2+ ion hier een belangrijke rol in speelt. Graag zou het CABO de beschikking
hebben over een techniek '"aarmee zij in staat is om non-invasief de ,.,aterhuishouding te bestuderen voor het bepalen van imo1endige verande-ringen in een plant. Het CABO start samen met de LU\ol onderzoek naar de energiekosten van onderhoudprosessen in planten. Hiervoor wordt de ATP- en eiwit-omzetting met behulp lSN en 31P in vivo gemeten.
COVP "Het Spelderholt"
Voor het COVP is het belangrijk te weten hoe de stikstof en fosfaat huishouding in het pluimvee plaats vindt. Deze vraag werd in de meest algemene zin gesteld. Dit ,.,il zeggen dat de lotgevallen van de ver-schillende stikstof- en fosfor-componenten door het dier heen gevolgd moesten '''orden, van het voer tot de mest.
Bovendien bestond behoefte aan meer parameters waarmee de k'o1aliteit van vlees zowel in het levend dier als van het geslachte produkt beter gedefinieerd kan worden.
CPO
Het CPO werkt aan de veredeling van gewassen en de uitbreiding van het assortiment gewassen. Binnen de plant vindt reallokatie van de syntheseproducten plaats. Dit proces gaat in de aardpeer samen met een polymerisatie van fructose en glucose tot inuline. De ketenlengte blij kt gereduceerd te '"orden vlak voordat het inuline opgeslagen wordt. De aandacht van het CPO gaat uit naar de bepaling van de poly-merisatiegraad in situ, koolhydraat fluxen en het polymerisatiemecha-nisme.
De concentratie koolhydraten is een belangrijke factor in de turgor van een systeem. De turgor en de suikerhuishouding zijn waarschijnlijk belangrijk voor de kwaliteit van een landbomo1produkt. Echter ook zet-meel en cellulose zijn polymeren van koolhydraten. Deze polymeren bepalen mede de tekstuur en struktuur van een vrucht. Lignine is waarschijnlijk een belangrijke factor voor de verteerbaarheid van een ge,·Tas.
Om te komen tot "lmo1 input" ge,.,assen is het noodzakelijk de benodigde hoeveelheid stikstof en fosfor voor een plant te kennen. Hoe worden deze elementen omgezet, opgeslagen of afgescheiden?
Deze onderzoeksvragen bleken in aanmerking te komen voor het gebruik van NHR technieken.
IB
Het onderzoek van het IB richt zich op de interaktie van
wortelsyste-men met de omringende bodem. Dit thema vindt zijn uitwerking in de
bestudering van opname- en omzettings-precessen van voedingsstoffen
uit de bodem door de plant. Belangrijke componenten zijn stikstof en
fosfor houdende verbindingen, zware metalen en alluminium. In het kader van de milieu problematiek wordt onderzoek verricht naar de
gevolgen van bemesting op deze processen.
IVO
Het IVO verricht onderzoek naar karkas- en vleeskwaliteit. Dit kunnen
metingen aan het levende dier, met een voorspellend karakter voor de
karkassamenstelling, zijn. Anderzijds zijn na het slachten van
betekenis voor de vleesk\o1aliteit: inzicht in het verloop van de pH in
het vlees (samenhangend met de glycogeen voorraad en het
energie-metabolisme), de struktuur/tekstuur en het \<Taterhoudend vermogen van
het vlees, de taaiheid, die ondermeer verbonden is met de hoeveelheid
en mate van crosslinking van het bindweefsel, de kleur etc.
Om te komen tot een hoog\<Taardiger produkt, heeft het IVO behoefte aan
alternatieve, meer objectieve parameters om de karkassamenstelling in
vivo vast te kunnen stellen en direct na slachting de k\<Taliteit van
het vlees.
Een en ander kan leiden tot een beter onderbom1d selectieprogramma (via snelle screeningsmethoden in vivo). ~laar ook \o1ordt het mogelijk
om beter de k\o1aliteit van het vlees te volgen in de verschillende
processen die na de slacht in het vlees plaats vinden.
IVVO
De k\<Taliteit van veevoeder is het onderzoeks gebied van het IVVO. De
interesse gaat uit naar de voedings\<Taarde en verteerbaarheid van dit
veevoer. Deze voedingswaarde dient vastgesteld te worden op basis van de eiwit-, energie- en mineraalhuishouding in een dier.
In het kader van de huidige milieu problematiek is het tevens van
belang de stikstof huishouding in een slachtdier te kennen. Zodat met
de samenstelling van het veevoeder geanticipeerd kan worden op de uitscheiding door dit dier.
RIKILT
Forensische taken en export problemen maken een analytische uitrusting noodzakelijk die leidt tot ondubbelzinnige analyse resultaten in het byzonder voor de confirmatie analyse van de onderhavige analyt.
Hiervoor zijn bovendien referentiematerialen noodzakelijk. N~m is van complementair belang ten opzichte van andere analyse methoden voor voornoemde taken van het RIKILT. Verdere toepassingen van N~ zijn nog van belang bij het onderzoek naar non-destructieve b1aliteitsanalyses.
STARING Centrum
Op het Staring centrum wordt onderzoek verricht naar de structuur van de bodem en de poriengeometrie en hun dynamiek, naar de fysische transportprocessen in en door de bodem, als ook aan het bodemj\oTortel systeem (i.s.m. het IB).
Een groot deel van het onderzoek vindt thans nog plaats aan met kunst-hars geïmpregneerde "ongestoorde" monstermaterialen. Hiervan worden dunne coupes vervaardigd, die microscopisch bestudeerd worden. Deze methode heeft een aantal bezwaren. Daarom is er behoefte aan methoden die niet-destructief zijn, die onderzoek in een veldvochtige toestand mogelijk maken, die informatie verschaffen in drie dimensies, die geschikt zijn om fysische transport processen te karakteriseren, die voldoende spectroscopische informatie leveren en die betrekkelijk eenvoudig en snel zijn. Men hoopt dat N~m in belangrijke mate in deze behoefte kan voorzien.
3.2 Centrale thema's.
In het kader van deze korte inventarisatie \•Tas het niet mogelijk al het onderzoek binnen de DLO instituten te toetsen op het gebruik van N~m technieken. \.Jel tekenden zich t\oTee tendensen af van informatie
die \•Taarschijnlijk met mm te verkrijgen is en binnen de verschillende onderzoeksgebieden zal leiden tot hoogwaardige kwaliteitsparameters.
1 Grote behoefte bleek te bestaan aan gelokaliseerde informatie over het koolhydraatmetabolisme in een plant. \.Jaar in een plant vinden omzettingen van de ene suiker in de andere suiker plaats en wat is het moleculaire mechanisme dat aan deze omzettingen ten grondslag ligt?
Via gecombineerde informatie uit de waterhuishouding en de suikerhuis-houding zal men waarschijnlijk in staat zijn uitspraken te doen over de kwaliteit van produkten en de ontwikkeling van die k\'laliteit in de verschillende produktie stadia van een gewas.
Een andere mogelijke toepassing van NMR kennis over koolhydraten is het screenen van afvalstromen op de aam1ezigheid van hoog\'laardige koolhydraten. Dit zou kunnen leiden tot een valorisatie van deze
afvalstromen, of misschien tot de agrificatie van nieu'\'Te ge\'lassen.
2 In het kader van de milieuproblematiek en de voedingswaarde van diervoeders bleek behoefte te bestaan naar inzicht in de stikstof-huishouding in de grond, het gewas en in het dier. Het betrof hier
ZO\'lel de behoefte aan gelokaliseerde informatie als ook aan moleculair mechanistische informatie.
De eiwit bepaling van produkten wordt vooralsnog gebaseerd op de
totale hoeveelheid stikstof in een produkt of gewas. Er bestaat grote
behoefte aan een beter onderscheid tussen de diverse stikstofhoudende
verbindingen in allerlei produkten om te komen tot een gefundeerd
oor-deel over de aamqezigheid van stikstofhoudende verbindingen zoals
nitraten en eiwitten in o.a. diervoeders.
Binnen dit kader valt ook de denitrificatie van grond en de stikstof-binding door een plant. ~1et de te verkrijgen kennis zou een bijdrage geleverd kunnen worden aan de verzuringsproblematiek als gevolg van de intensieve veehouderij.
Naast deze twee grote tendensen werden relatief kleinere onderzoeks-vragen bij de diverse instituten aangetroffen die in aanmerking kunnen komen voor het gebruik van NHR technieken.
Waar in een plant vindt fosfaat opslag en omzetting plaats? Fosfaat immers is een belangrijke indicator voor de vitaliteit van een plant of dier. Als de fosfaathuishouding beter bekend is kan de invloed van
bij voorbeeld pesticiden op de vitaliteit onderzocht worden.
Is met NHR de eh'lit/vet verhouding in vlees vast te stellen, zodat gekomen kan worden tot een correlatie met de vleesk\'lali te i t?
Zijn metabole studies met celk\'leeksystemen met NHR te volgen?
Wat is de coordinatie en functie van verschillende metaalionen (Al,
Cd, Hg, Pb) in de bodem? Wat is de rol van het Ca2+ en Mg2+ ion in
een plant?
Op termijn bieden deze gebieden voldoende innovatief NMR onderzoek
binnen de verschillende DLO instituten.
In het volgende hoofdstuk zal gekeken worden hoe deze vragen met N~ffi
technieken te onderzoeken zijn.
4 NMR EN ORGANISATIENIVEAUS
De verschillende onderzoeksvragen bleken niet voldoende abstract om
direct aan een N~ffi techniek gekoppeld te worden. Daartoe zal in het
komende hoofdstuk een onderscheid gemaakt worden tussen de
verschil-lende niveaus waarop de onderzoeksvragen zich bevinden, moleculair,
cellulair, organistisch, individueel of populatief. De verschillende
onderzoeksvragen bleken vervolgens in te passen te zijn in een matrix
met als kolommen deze vijf categorieen en in de rijen de vijf NMR
technieken, l.r. N~ffi, h.r.N~ffi, M.A.S., imaging en gelokaliseerde
spectroscopie (lok.spec.). Met enkele toepassingen zal het belang van
N~ffi technieken op de verschillende niveaus aangegeven '~orden.
Matrix voor de koppeling van onderzoeksvragen aan NMR technieken(*).
I molecuul cel orgaan individu populatie
I
l.r. N~ffi I mol 1 cel 1 org 1 pop 1
I
h.r. N~UR I mol 2 cel 2 pop 2
I
M.A.S. I mol 3
I
imaging I org 4 ind 4 pop 4
I
lok.spec. I
-
org 5 ind 5 pop 5(*) Het bodemonderzoek zal apart besproken worden omdat inpassing in
4.1 Moleculair niveau
mol 1
Op moleculair niveau is NMR een uitstekende techniek om de identiteit
van een molecuul vast te stellen. ~let behulp van een eenvoudige
spec-trometer zijn zonder veel problemen identificaties te maken van
mole-culen tot een moleculair gewicht van 500 dalton. Hiervoor is wel het
gebruik van een set referentie spectra noodzakelijk. De toekenning van
zeer eenvoudige moleculen kan gemaakt \<lorden op grond van de parate
NMR kennis van de spectroscopist.
mol 2
Het behulp van een h.r. NMR spectrometer (mol 2) zijn
molecuulstruc-turen vast te stellen van moleculen in een oplosmiddel. ~let behulp van
correlatiespectroscopie zijn ruimtelijk molecuulstructuren van
eiwit-ten of DNA-strands met een gewicht van 20k dalton geproduceerd. Dit is
mogelijk omdat dergelijke structuren bestaan uit regelmatig herhalende
patronen, zodat sequentieel door het molecuul heen gestapt kan worden.
Dit geeft een strategie bij het toekennen van de diverse signalen.
Ook kunnen grote complexen van moleculen bestudeerd worden omdat in-formatie beschikbaar is over ruimtelijke afstand tussen twee atomen van b.v. twee verschillende moleculen in een dergelijk complex. Op deze wijze kan inzicht verkregen worden in host/guest relaties van
enzym/substraat of eiwit/DNA complexen. Niet isotrope systemen kunnen
met h. r . NMR onderzocht \<lorden. Dit \<lerk vindt toepassingen in metingen
aan dubbellagen van phospholipiden.
mol 3
Met behulp van magie angle spinning zijn N~1R spectra op te nemen van
vaste stoffen. Door de hoge spinsnelheid heeft deze techniek een
4.2 Cellulair niveau
cel 1
Op cellulair niveau is met een eenvoudige puls N~ffi spectrometer door
middel van t2 relaxatie metingen de waterverdeling over verschillende
cel campartinenten vast te stellen. Enige homogeniteit van het onder-zochte weefsel is een vereiste.
cel 2
Het metabolisme van een cel is op verschillende manieren met een
h.r.NHR spectrometer te onderzoeken.
Een zeer elegante methode is het aanbieden van een verrijkte
voedings-stof aan een cellulaire suspensie. Indien aan een dergelijke suspensie b.v. 13C verrijkt glucose wordt toegevoegd is het mogelijk de omzet-ting van dit glucose in de tijd te volgen. Door de integraal van de spectra op te nemen zijn metabolische processen te k\•lantificeren ten
opzichte van elkaar. Deze methode kan ook gebruikt worden voor de lSN
huishouding. Het voordeel van de verrijking is de grote signaal-ver-sterking van het stuk metabolisme dat bestudeerd moet worden. Deze versterking is het gevolg van het lage natuurlijke voorkomen van deze t\•lee kernen.
Als een enzymatische reactie voldoende snel verloopt, is het mogelijk
om met h. r. N~ffi het substraat voor de reaktie te "magnetiseren" en na
de reactie te detecteren. Hierdoor komt informatie beschikbaar over
de snelheid w·aarmee substraat omgezet \•lordt door het betrokken enzym.
Natuurlijk is ook de terug reactie waar te nemen. Indien de cel in
redelijke rust is zullen deze twee reacties even snel zijn. Wanneer
het metabolisme echter uit balans is zullen deze twee snelheden gaan
verschillen. Deze methode is bij uitstek geschikt om snelle metaboli-sche processen te bestuderen. Deze methode is alleen toepasbaar voor
reacties die een "NHR-zichtbaar" substraat hebben.
Het behulp van 31P N~ffi is het mogelijk om non invasief de pH van een compartiment in een cel vast te stellen of de fosfor huishouding te
volgen. Uit de verhouding van de fosfor signalen van ATP en ADP is
4.3 Orgaan
org 1
Met behulp van een eenvoudige spectrometer is bij voorbeeld snel de
'~aterjvet verhouding van een orgaan vast te stellen. Na een
criente-rend onderzoek is het misschien mogelijk om hier het eiwit gehalte aan toe te voegen.
Het een dergelijke, eenvoudige, machine '~ordt hoofdzakelijk dedicated
'~erk verricht. Voorafgaand aan dit '~erk dient met een meer geavanceerd
apparaat de mogelijke toepassing onderzocht en vastgesteld te worden.
org 4
Een eenvoudige imager is in staat om snel een plaatje op te nemen van een orgaan. Op deze manier wordt een verdeling van een goed "zichtbare" kern verkregen. \.[anneer gekeken '~ordt naar een zeer alge-meen aam~ezige kern in een orgaan zal het N~1R plaatje niet veel ver
-schillen van een CT-scan. Echter met N~ kan ook naar andere kernen gekeken \•lorden. \.[anneer een orgaan geen gewoon water maar Z\~aar '~a ter aangeboden krijgt is de doorstroming van dit orgaan te volgen (~luller
&
Seelig,l987). Dit zelfde experiment kan ook met lSN uitgevoerd'~orden. Zodoende zou de accumulatie van stikstof verbindingen in een orgaan onderzocht kunnen worden.
Tot zover werden alleen dichtheidsverdelingen beschouwd. Verdelingen van het relaxatiegedrag van kernen over een orgaan zijn ook goed denkbaar. Hierdoor komt informatie beschikbaar over de gebondenheid van een kern aan zijn omgeving. Op deze manier \•7erd de appel "red delicieus" onderzocht op de aam~ezigheid van '~ater in zijn kern
(Wang et al. ,1988) .
org 5
Met behulp van lokale spectroscopie kunnen metabolische processen in een orgaan gevolgd worden zonder het orgaan te hoeven beschadigen. Reeds op omvangrijke schaal werd 31P N~ bedreven aan organen.
Hierdoor was het mogelijk om inzicht te verkrijgen in de energiehuis
Ook zijn al experimenten gedaan naar de lokale spectroscopie van natuurlijk voorkomend 13C en verrijkt 13C. Hiermee is het metabolisme van een orgaan te volgen nadat de verrijkte voedingsbron het orgaan instroomt.
De mogelijkheid is tevens aam.,ezig om van meerdere volume elementen een spectrum op te nemen waarna de verdeling van een signaal uit de spectra bekeken kan worden.
De selectie van het te bestuderen orgaan kan op verschillende manieren gebeuren, direct, door middel van een oppervlaktespoel of door middel van een inductie-gekoppelde-spoel. Een voordeel van deze laatste tech-niek is de mogelijkheid om de ontwikkeling van een proefdier over langere tijd te volgen. De spoel blijft in het dier aamrezig ter\oTijl het dier in zijn natuurlijke omgeving voortleeft.
Door middel van de selectie van een "volume of interest" \-las het moge-lijk om uitspraken te doen over de vetzuursamenstelling van patienten die leiden aan "neuromuscular diseases" op grond van het lH NHR
spectrum van dit volume (Barany et al. ,1989).
Het behulp van een oppervlaktespoel werd reeds het rijpingsproces van een avocado gevolgd (Bennett et al. ,1987).
Door een viervoudig afgestemde inductie-spoel in een kat in te brengen was het mogelijk om tegelijkertijd het natrium-, lactaat- en
fosfaat-metabolisme en de bloedstroom waar te nemen (Eleff et al. , 1988).
4.4 Individu
ind 4
Van een geheel individu kan met NHR een doorsnede gemaakt \-lorden \•Taarmee bij voorbeeld de aamoTezigheid van tumoren vast te stellen is. Dit kan gedaan \'lorden op grond van een verdeling van de aamoTezigheid of het relaxatie gedrag van een kern. Verrijking biedt ook nu weer de krachtige toepassing om de flux door het gehele individu heen te vol-gen. Er is geen verschil met het gebruik van N~ffi technieken op orgaan niveau.
ind 5
Met behulp van lokale spectroscopie zou de ontwikkeling van een ver-binding in een dier of plant gevolgd kunnen worden van de opname tot de uitscheiding. Als de concentraties voldoende hoog blijven kan
waarschijnlijk ook vastgesteld worden in welke verbinding de te volgen atoomkern aam1ezig is. Door het toepassen van NMR zou het gebruik van radioactieve tracers gedeeltelijk vermeden kunnen '~orden. Hierdoor komen omslachtige en vaak dure veiligheidsmaatregelen te vervallen en ontstaat in deze gevallen geen radioactief afval.
4.5 Populatie
Het gebruik van N~ffi technieken op populatie niveau is een afgeleide van het gebruik van N~ffi technieken op de vier overige niveaus. Door middel van k\~aliteitsparameters, vastgesteld op een van de overige niveaus, '~ordt het mogelijk om te komen tot rasverbetering van ge,~as sen en fokdieren. Hier ligt op termijn de kracht van non invasief N~ffi onderzoek binnen DLO.
4.6 Bodemonderzoek
Met behulp van afbeeldende N~ffi zal het mogelijk zijn drie-dimensionale afbeeldingen van bodemmonsters te maken zonder deze te prepareren. Zodoende wordt het mogelijk inzicht te krijgen in bodemstrukturen, transportprocessen en wortelsystemen. Ook zal het volgen van een bodemsysteem in de tijd de moeite '~aard zijn. Op deze manier kan de jaarlijkse dynamiek van een bodemstruktuur en de groei van een '~ortel stelsel in de volle grond of op een substraat gevolgd worden.
Relaxatie metingen bieden een mogelijkheid voorspellingen te doen over lokale diffusiesnelheden van water. Door middel van verrijking kunnen omzettingen van stikstofhoudende verbindingen in de grond gevolgd wor -den.
Dit zijn enkele mogelijkheden voor het gebruik van N~ffi technieken in het onderzoek van DLO. De mogelijkheden voor het gebruik van NMR technieken rechtvaardigen de realisering van een NMR faciliteit.
5 APPARATUUR EN INFRASTRUKTUUR
Nu bekend is hoe N~~ technieken een optimale bijdrage kunnen leveren
aan t\•Tee onderzoeksthema's binen DLO zal nader ingegaan worden op de realisering van een N~~ faciliteit.
Zoals uit de bovengenoemde voorbeelden mag blijken moet N~1R voldoende
mogelijkheden bieden om een bijdrage te leveren aan de t\'lee onder-zoeksthema's zoals die voor DLO afgeleid zijn. Om deze onderzoeksthe-ma's optimaal te exploreren moeten t\'lee soorten N~1R experimenten ver-richt kunnen \'lorden.
Op moleculair en cellulair niveau moet de identificatie van
individue-le moleculen verricht kunnen worden. Op dit niveau vindt het onderzoek
naar metabelismen plaats. Voor het waarnemen van verdelingen en trans
-lokatieprocessen is de beschikking over een afbeeldende faciliteit
noodzakelijk.
De mogelijkheid bestaat om deze t\'lee functies in een apparaat te
com-bineren. Echter in een dergelijke opstelling is de maximale
veldsterk-te omgekeerd evenredig aan de diameter van de magneetopening. Derhalve
dient aangegeven te worden naar welk soort experimenten de voorkeur
uit gaat.
Uit de inventarisatie bleek dat beide soorten experimenten even
be-langrrijk gevonden worden. De magneet van een dergelijk apparaat zou
een horizontale opening van 20 cm diameter en een veldsterkte van 4.7
Tesla hebben. Door deze t\'lee functies te combineren in een apparaat zijn consessies gedaan aan zowel de spectrale resolutie als de maxi-maal beschikbare monsterruimte.
Zoals reeds aangegeven werd dient de maximale resolutie af te hangen
van de taak die een N~~ apparaat krijgt. Indien op het apparaat gea -vanceerd moleculair mechanistisch onderzoek verricht moet worden,
naast het afbeelden van grote monsters dient de mogelijkheid van de
aanschaf van t\'lee apparaten oven.,ogen te \•lorden. Door samem'lerking met de LUH kan toegang verkregen ,.,orden tot apparatuur die een extra
dimensie aan de faciliteit kan geven.
Indachtig het gezegde ''Iets wat waard is gedaan te worden, is waard goed gedaan te '"orden" '"ordt aangeraden te komen tot de aanschaf van
t\'lee apparaten, te ,.,eten een hoge resolutie NAA spectrometer en een
Om zo '~einig mogelijk beperkingen van monsterkeuze te hebben dient de hoge resolutie spectrometer voorzien te zijn van een micro-irnaging mo-gelijkheid.
5.1 Apparatuur
Voordat tot de aanschaf van een of meer apparaten overgegaan wordt zal het aanbod van N~1R apparatuur grondig getoetst moeten worden aan
de uiteindelijke gebruiksdoeleinden, aanschafkosten, onderhoudskosten,
exploitatiekosten en de gebruikersvriendelijkheid. Een dergelijke
inventarisatie heeft nog niet plaats gevonden.
Hoge-resolutie N~1R spectrometer.
Om op niveau N~1R spectroscopie te kunnen bedrijven zal de faciliteit
over een spectrometer met voldoende oplossendvermogen moeten beschik
-ken. Dit komt neer op een spectrometer met een veld van 11.7 Tesla.
Omdat deze spectrometer voor meerdere kernen gebruikt zal gaan worden
dient hij voorzien te zijn van een breedband zendjontvangst unit naast
de standaard 500 ~fuz proton zender/ontvanger. Het meten aan in vivo
systemen vraagt een grote selectiviteit om ongewenste signalen te
on-derdrukken. Deze selectiviteit is optimaal te bereiken met een
selec-tieve excitatie unit. Ook dient op dit apparaat een breedband
ontkop-pel zender aanwezig te zijn.
Zoals reeds was genoemd dient een micro-irnaging mogelijkheid op dit
apparaat zeker aam.,ezig te zijn, hoe\•lel de prioriteit van dit apparaat
de spectroscopie moet te blijven.
Imaging systeem
Aan de keuze van een imaging systeem behoren verschillende argumenten
ten grondslag te liggen.
Omdat de tijdsduur van de experimenten niet critisch is dient het veld
van de te gebruiken magneet aan het experiment aangepast te zijn.
Hierdoor zal een maximale afbeeldende resolutie verkregen ,.,orden. Over
het algemeen moet de veldsterkte zo hoog mogelijk zijn. Het is dan
optimaal mogelijk lokale spectroscopie te bedrijven. De omvang van de
te bestuderen objecten zal de binnendiameter van de opening van de
zo goed mogelijk in de magneet te laten passen is een grote
binnendia-meter een verreiste. Veel ruimte in de magneet gaat verloren aan de
shirn- en gradient-spoelen. Bovendien vragen proeven met planten om nauwkeurig gecontroleerde condities. Hiertoe zal de plant in een
aparte cylinder in de magneet gebracht moeten kunnen ,.,orden. Deze twee factoren reduceren de vrij ruimte binnen de magneet aanzienlijk.
Een ander punt van overweging is de stand van de magneet. De aanschaf-prijs van een magneet met een vertikale opening ligt aanzienlijk hoger
dan de prijs van een magneet met een horizontale opening. Tevens
zul-len de exploitatie kosten verschillen hoewel hier ,.,einig over bekend
is. Echter zwaartekrachts gevoelige planten experimenten met b.v. groeistoffen of wortelsystemen vragen om een verticale magneet ope-ning. De ervaringen met een vertikale magneet van deze afmeting zijn zeer beperkt.
Omdat het de bedoeling is dat ook andere dan lH kernen op dit apparaat gemeten zullen gaan ,.,orden is de aamo1ezigheid van een breedband
zend-en ontvangst-unit noodzakelijk. De diversiteit aan monsters zal ook
een breed scala aan zend en ontvangst spoelen vragen. Bij de facili-teit zal zeker een mogelijkheid aamo1ezig dienen te zijn om probleem-specifieke spoelen te vervaardigen.
Omdat veel monsters veel water bevatten en omdat het de bedoeling is
gelokaliseerde spectroscopie te gaan bedrijven is de aamo1ezigheid
van een selectieve excitatie unit noodzakelijk. Hiermee zal het moge-lijk zijn om verdelingspiaatjes te rnaken op basis van de chernical shift van een kern.
De gedachten gaan uit naar een irnager met een 4.7 Tesla/40 cm. magneet met, naast een proton zender/ontvanger, een breedband zender/ontvanger en een selectieve excitatie unit.
5.2 Infrastructuur
Om een faciliteit met een bovenbeschreven opbomo1 optimaal te laten functioneren zijn een aantal infrastructurele voorwaarden
Bestuurlijk kader:
Op bestuurlijk niveau zal beslist moeten worden hoe de meettijd over
de verschillende onderzoeken verdeeld gaat worden en waar de
verant-woording voor het wetenschapsbeleid en de exploitatie ligt. Een goede
communicatie tussen de verschillende betrokken partijen is van
essen-tieel belang. Misschien moet een overleggroep rond de faciliteit
opge-richt worden. De taak voor deze groep kan op bestuurlijk niveau nader
ingevuld worden. Ook is het raadzaam een dergelijke faciliteit een
naambekendheid mee te geven, wat een fondsen wervend karakter kan
heb-ben. Voorts mag niet nagelaten worden ontwikkelingen elders, m.n. in
Nederland en Europa op de voet te volgen.
Personele infrastruktuur:
- 1 academicus: Per apparaat zal een academisch gevormd beheerder
nodig zijn. Hij dient in staat te zijn om de onderzoeksvragen zoals
die uit de instituten komen te vertalen naar een NMR oplossing.
Hiertoe moet hij voldoende contact houden met het NMR onderzoek zoals
dat aan de universiteiten en in het bedrijfsleven wordt verricht. Ook
zal hij in staat moeten zijn om prioriteiten toe te kennen aan het
ge-bruik van de faciliteit. Dit wil zeggen dat hij verantwoordelijk is
voor het laten uitvoeren van het noodzakelijke onderhoud en een
door-slaggevende stem heeft in de opvulling van de meettijd van de
facili-teit. Hij is verantwoordelijk voor het apparaat.
- 1 operator: Voor het begeleiden van de experimenten en de dagelijkse
gang van zaken op en rond een apparaat zal er een operator nodig zijn.
Deze man moet in staat zijn om de bezoekende onderzoekers te
begelei-den in het gebruik van de spectrometer en eventueel zelfstandig de
verschillende experimenten uit te voeren.
- 1 technicus: Van deze technicus mag verwacht worden dat hij in
staat is klein onderhoud aan de spectrometers zelf te verrichten.
Voor het groot onderhoud moet hij in staat zijn overleg te plegen met
de bezoekende technici. Tevens zal hij kennis moeten hebben van de
bij het apparaat aanwezige hard- en software. Hij is verantwoordelijk
voor het technisch optimaal functioneren van de, voor de faciliteit
Materiele infrastruktuur:
Bij de aanschaf en plaatsing van een NMR apparaat dienen de volgende materiele voorwaarden aanwezig te zijn:
- gewaarborgde vloeibare He en N2 aanvoer,
- monster preparatie ruimten (kassen, kooien of aquaria, labruimten)
- goedgekeurd vertrek voor de magneet (strooiveld van de magneet,
trillingsgevoeligheid van het gebouw en bereikbaarheid),
- toegang tot een ruime literatuur voorziening, eventuele eigen
literatuur.
Dit zijn vooralsnog de belangrijkste facetten die in overweging
geno-men dienen te worden bij de aanschaf van een NMR faciliteit.
6 CONCLUSIES
Om een bijdrage te leveren aan de twee onderzoeksthema's wordt voorge-steld te komen tot de aanschaf van twee apparaten, te weten een 4.7 Tesla/40 cm imaging apparaat en een 500 Mhz hoge resolutie
spectrome-ter inclusief de mogelijkheid voor micro-imaging.
Op de hoge resolutie spectrometer moet moleculair mechanistisch en
cellulair metabolisch onderzoek verricht worden. Het imaging apparaat
moet gebruikt worden om strukturen waar te nemen en om de lokallsering
van metabolische processen uit te kunnen voeren.
Een apparaat met en 4.7 Tesla/20 cm. magneet schiet tekort vanwege de
consessies die, in dat geval, aan de spectrale en afbeeldende
resolu-tie gedaan worden. De voorgestelde configuraresolu-tie is minimaal noodzake-lijk om de faciliteit in staat te stellen de gestelde onderzoeksvragen
optimaal te beantwoorden. Goede afspraken en een overlegstruktuur zijn
nodig om de faciliteit optimaal voor de DLO instituten te benutten.
Samenwerking met de LUW biedt de voordelen dat daar reeds ervaring is opgedaan met NMR werk binnen landbouwkundig onderzoek en dat een breder (rand)apparatuurpark toegankelijk wordt, bij voorbeeld een
laagveld imager voor bodemonderzoek, andere laag-veld apparaten en
computerondersteuning.
AANBEVELING
Voor de plaatsing van nieu,qe apparatuur in een gemeenschappelijk Agro-biologisch NHR-centrum in \vageningen wordt de volgende aanbeveling gedaan:
het 500 HHz NHR instrument plaatsen op het RIKILT, prijs 2 à 2,5 miljoen, afhankelijk van firma en mogelijke kortingen bij aanschaf in combinatie met het andere instrumment.
het 4.7 Tesla/40 cm imagingapparaat plaatsen op de Lrnv, prijs ca. 4,5 miljoen, eveneens afhankelijk van firma en eventuele kortingen. De aanbeveling moet in zijn totaal ,.,orden bezien. Indien de Lffiv niet zou overgaan tot aanschaf van het imaging apparaat wordt het non-des-tructief k\qaliteitsonderzoek onmogelijk voor objecten groter dan 2 cm. Voor het RIKILT is dergelijk onderzoek steeds een belangrijke onder-bomTing ge,qeest voor de aanschaf van NHR apparatuur.
De spreiding van de lokatie over twee plaatsen wordt overigens door de deelnemers niet als bezwaarlijk ondervonden door de geringe afstand tussen LU\ol en RIKILT.
LITERATUUR
}1.Barany, P.N.Venkatasubramanian, E.Mok, I.M.Siegel, E.Abraham, N.D.\vycliffe
&
M.F.Mafee, Quantitative and Qualitative fat analysisin human leg muscle of neuromuscular diseases by lH }ffi spectroscopy in vivo, Magnetic Resonance in medicine (1989) 10, 210-226.
A.B.Bennett, G.M.Smith and B.G.Nichols, Regulation of climacteric respiration in ripening avocado fruit, Plant Physiol. (1987) 83, 973-976.
S.M.Eleff, M.D.Schnall, L.Ligetti, M.Osbakken, V.Harihara
Subramanian, B.Chance
&
J.S. Leigh jr., Concurrent measurements ofcerebral blood flow, sodium, lactate, and high-energy metabolism using 19F, 23Na, lH and 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy, Magnetic Resonance in medicine (1988) 7, 412-424.
D.G.Gadian, Nuclear magnetic resonance and its applications to living systems, Clarendon Press, Oxford 1982.
S. Muller
&
J. Seelig, In vivo NMR imaging of deuterium, Journalof magnetic resonance (1987) 72, 456-466.S.Y.Wang, P.C.Wang
&
M.Faust, Non-destructive detection of watercore in apple with nuclear magnetic resonance imaging, ScientiaGESPREKSPARTNERS r8938 dr. W.G. van Doorn dr. H.M. Dekhuijzen ir. A.T.G. Steverink dr. H.J. Huizing drs. P. Del Castilho dr. J.F.Th. Schoute prof. dr. T.J. Schaafsma dr. H. van As dr. C. Dijkerna
dr. J.M. van der Meer
dr. G.J. Garsen dr. J.J. Dekkers ir. P. Sterrenburg dr. ir. J.J.M. Vervoort ATO CABO COVP CPO IB Staring centrum Lrnv Lrnv Lrnv IVVO IVO DLO IVO Lrnv
