De ontwikkeling en validatie van een UHPLC-DAD-(ESI-MS/MS) methode voor de analyse op acepromazine maleaat, onzuiverheden, nipagin en nipasol in veterinaire farmaceutische producten

BACHELOR SCRIPTIE

De ontwikkeling en validatie van een UHPLC-DAD-(ESI-MS/MS) methode voor de analyse

op acepromazine maleaat, onzuiverheden, nipagin en nipasol in veterinaire

farmaceutische producten

ACADEMIEJAAR

2013-2014

FACULTEIT ACADEMIE VOOR DE TECHNOLOGIE VAN GEZONDHEID EN MILIEU

LOKHIM WONG

Titelpagina

Academie: Avans Hogeschool

Lovensdijkstraat 61-63 4818 AJ Breda

Tel. +31-076-52505

Bedrijf: Produlab Pharma B.V.

Forellenweg 16

4941 SJ Raamsdonksveer 0162-523000

Auteur: Lokhim Wong

2039684

Lhwong@avans.nl

Docent: Drs. Ing. N. Sewgobind

Mentor: H.A.J. van Kessel

Begeleider: A. van der Heiden

Plaats: Raamsdonksveer

Datum: Januari 2014

Type rapport: Bachelorscriptie

A

BSTRACT

In this study, an UHPLC-DAD method was developed for the qualification and quantification on ACE (acepromazine maleate), impurities, nipagin en nipasol in L13082904 and L13082906. The known impurities S-oxide, 2-acetylphenothiazine and phenothiazine will be quantified with a response factor of 1.985, 0.985 and 2.253 respectively based on a calibration curve of ACE. The proposed method can be used for routine analysis in Produlab Pharma.

Chromatographic separation was achieved on a Acquity CSH-C18 (75 mm x 3.0 mm, 1.7 µ) column using 100 mM ammonium formate (pH 3.8) as mobile phase A and acetonitril as mobile phase B, with a flow of 1.0 mL/minute, an injection volume of 6 µL and a column temperature of 50°C. The analyses was performed at 254 nm and has a total runtime of 10.0 minutes. A gradient system were applied with the following time program: T (minutes), A:B (v/v%); A:B (v/v%); T0.1, 83/17, T2.4, 74/26,

T5.4, 74/26, T5.5, 55/45, T8.6, 55/45 en T8.7, 83/17. The test samples were prepared to the desire

concentration ACE (100 mg/L), nipagin (100 mg/L) and nipasol (10 mg/L).

The developed method was fully validated according the VICH-guidelines with respect to specificity, linearity, detection limits, accuracy and precision.

Results of the separation performance (resolution, tailing factor and theoretical plates) and the corresponding chromatogram indicates the method specific.

The developed method was linear for ACE, nipagin and nipasol with a reach of 50-150, 50-150 and 5-15 mg/L respectively. The corresponding correlation coefficient were all >0.999.

The theoretically LOQ of ACE (354 µg/L), nipagin (71 µg/L) and nipasol (70 µg/L) were determined. Good recovery’s (95.63 -101.79%) and correlation coefficient (>0.997) of the analytes on LOQ-level were obtained to confirm those limits.

Accuracy of the compounds was determined on 3 different concentration levels (80, 100 and 120%). The recoveries of the measured samples were between 97.81 and 100.96%, with a maximum RSD of 1.71%. Precision of the method was examined by a repeatability and intermediary precision. Both results shows a good yield between 97.81 and 101.58 % with an RSD of 1.71%.

During the stability study, no degradation or shift in retention time (>5%) were observed on the mobile phase, standard and test solutions.

The stress research shows the degradation of ACE to ASO under oxidative conditions. The increasing concentration of hydrogen peroxide (10%) leads to a fully degradation of ACE to ASO. Exposure of ACE to acid, alkaline and thermal conditions did not show any degradation products. Stressing with sunlight and UV of the samples shows an increase of ASO. The corresponding mass balance were all declared.

The unknown impurity were identified on a UHPLC-DAD-MS/MS as a possible molecule with the formula C19H24N2OS (M =328.1609) or C18H20N2O2S (M = 328.1245). Further fragmentation on the

compound can help the identification of the unknown impurity. Another methodology is to isolate and purify the interested compound with preparative LC, followed by the determination of the exact mass with an LC-IT-TOF. This technique is more specific as the triple quadrupole.

S

AMENVATTING

In deze studie werd een UHPLC-DAD methode ontwikkeld voor de kwalificatie en kwantificatie op ACE (acepromazine maleaat), onzuiverheden, nipagin en nipasol in L13082904 en L13082906. De bekende onzuiverheden acepromazine S-oxide (ASO), 2-acetylfenothiazine en fenothiazine zullen gekwantificeerd worden met een responsfactor van respectievelijk 1.985, 0.985 en 2.253 op een kalibratielijn van ACE. De ontwikkelde methode kan als een routine analyse bij Produlab Pharma worden toegepast.

Chromatografische scheidingen tussen de componenten werden bewerkstelligd op een Acquity CSH-C18 (75 x 3.0mm, 1.7µm) kolom. De optimale resultaten werden verkregen met een 100 mM ammoniumbuffer (pH 3.8) als mobiele fase A en acetonitril als mobiele fase B, een flow van 1.00 mL/minuut, een injectievolume van 6 µL, een kolomtemperatuur van 50 °C, een golflengte van 254 nm en een totale analyseduur van 10.0 minuten. Het gradiëntsysteem werd toegepast met de volgende tijdsprogramma: T (minuten), A:B (v/v%); T0.1, 83/17, T2.4, 74/26, T5.4, 74/26, T5.5, 55/45,

T8.6, 55/45 en T8.7, 83/17. De te analyseren testmonsters moeten opgewerkt worden naar de

gewenste concentratie ACE (100 mg/L), nipagin (100 mg/L) en nipasol (10 mg/L).

De methode is volledig gevalideerd op de specificiteit, lineariteit, detectielimieten, precisie, en accuracy volgens de VICH-richtlijnen.

Resultaten van het scheidend vermogen (resolutie, tailing factor en schotelgetal) en de bijbehorende chromatogrammen indiceren op een specifieke methode.

De ontwikkelde methode was lineair voor ACE, nipagin en nipasol tussen een bereik van respectievelijk 50-150, 50-150 en 5-15 mg/L. De bijbehorende correlatiecoëfficiënt waren allen >0.999. De LOQ van ACE, nipagin en nipasol werd theoretisch bepaald op respectievelijk 354, 71 en 70 µg/L. Goede recovery’s (95.63 – 101.79%) en correlatiecoëfficiënten (>0.997) van de analyten op LOQ-niveau werden verkregen om deze limieten te bevestigen. De accuracy van de componenten werd bepaald op drie verschillende concentratieniveaus (80, 100 en 120%). In alle gemeten oplossingen werden de gemiddelde recovery’s tussen de 97.81 en 100.96% gedetermineerd met een maximale RSD% van 1.71. De precisie van de methode werd bepaald op basis van de herhaalbaarheid en intermediaire precisie. Beide kerngrootheden gaven een hoge rendement weer van de componenten. Deze varieerden tussen de 97.81 en 101.58% met een maximale RSD van 1.71%. Uit de stabiliteit studie is gebleken dat zowel de testoplossingen als de mobiele fase minimaal 3 dagen houdbaar zijn. Er werd geen afbraak of retentieverschuivingen groter dan 5% aangetoond. Tijdens het stress onderzoek werd ACE onder oxidatieve condities gedegradeerd tot ASO. Door toename van de concentratie waterstofperoxide (10%) kan ACE volledig worden omgezet naar ASO. De blootstelling van ACE aan hydrolytische en thermische omstandigheden vormden geen degradatieproducten. De met zonlicht en UV gestreste testoplossingen indiceert een toename van de ASO. De bijbehorende massa balansen werden allen verklaard.

De onbekende onzuiverheid werd op de UHPLC-DAD-MS/MS geïdentificeerd als een mogelijke molecuul met de brutoformule C19H24N2OS (M =328.1609) of C18H20N2O2S (M = 328.1245). Verdere

fragmentatie van het component kan een ondersteunende factor zijn voor de verklaring van de onbekende onzuiverheid. Een andere methodiek is de component opzuiveren met een preparative

V

OORWOORD

De scriptie welke voor u ligt is het resultaat van een methodeontwikkeling voor farmaceutische producten binnen Produlab Pharma. Het project is uitgevoerd in het kader van mijn afstuderen ter afronding van de studie Analytisch Chemie aan de Avans Hogescholen te Breda. Alvorens u de scriptie gaat lezen, wil ik graag mijn dank uitspreken aan een aantal bedrijven en personen.

Ten eerste gaan woorden van dank uit naar Produlab Pharma, welke mij de mogelijkheid heeft gegeven om af te kunnen studeren. Binnen deze periode heb ik mijzelf zowel persoonlijk als professioneel kunnen ontwikkelen. Dit heeft bijgedragen aan een goede voorbereiding op het toekomstige werkveld.

Daarnaast wil ik graag mijn afstudeermentor Ronald van Kessel bedanken voor zijn begeleiding. Zijn kennis en ervaring op het werkveld heeft mij doen inzien hoe belangrijk de balans is tussen het idealistische en commerciële aspect binnen een bedrijf. De samenwerking heb ik als zeer prettig en vooral leerzaam ervaren.

Tevens gaat mijn dank uit naar mijn afstudeerbegeleider Arjan van der Heiden. Zijn praktische ondersteuning, voornamelijk de kennis over de instrumentatie UHPLC, en het logisch beredeneren van verschillende situaties zijn erg belangrijk geweest voor mijn project.

Ook wil ik mijn afstudeerdocent Nishant Sewgobind bedanken voor zijn feedback op mijn geschreven rapporten en visie betreft mijn toekomst. Ondanks zijn drukke agenda, is hij altijd bereid om essentiële vragen te beantwoorden.

Mijn speciale dank gaat uit naar het bedrijf Shimadzu. Zij gaven mij de kans om ervaringen op te doen omtrent het onderwerp massa spectrometrie. Persoonlijk was dit voor mij een vooraf gesteld doel dat ik graag wilde bereiken. Binnen deze organisatie wil ik in het bijzonder Vincent Goudriaan bedanken voor zijn tijd, geduld en kennisoverdracht. Zijn creatieve inbreng en feedback maakte het schrijven van mijn scriptie een stuk eenvoudiger. Tevens wil ik Corné Tak bedanken voor zijn tijd en rondleiding in een demonstratie lab van Shimadzu te Duisburg. Hierdoor is mijn kennis verrijkt op het gebied van de nieuwste apparatuur.

Verder een woord van dank aan René Vissers, welke met zijn theoretische kennis en kritische stellingnames mijn onderzoek tot een hoger niveau heeft geleid.

Graag wil ik ook alle collega’s van Produlab Pharma bedanken voor de ondersteuning binnen het project en een plezierige werkomgeving.

Tot slot, en niet als laatste, wil ik mijn familie en vrienden bedanken voor de steun en adviezen rondom mijn afstudeerperiode. Allen waren oprecht geïnteresseerd in mijn bezigheden met als gevolg dat ik met vol vertrouwen deze studie ga afronden en met een frisse moed het werkveld op zal gaan.

Lokhim Wong Breda, januari 2014

I

NHOUD

1.2 Nipagin & nipasol ... 14

2. Technieken ... 16

2.1 Ultra High Performance Liquid Chromatography ... 16

2.1.1 Van Deemter vergelijking ... 17

2.1.2 Pomp... 18

2.1.3 Sample injector ... 19

2.1.4 Kolom ... 19

2.1.5 Diode array detector ... 20

2.2 Massaspectrometrie ... 21

2.2.1 Electro Spray Ionisatie ... 21

2.2.2 Triple Quadrupole MS/MS... 23 2.2.3 Koppeling UHPLC-ESI-MS/MS ... 24 3. Validatie ... 26 3.1 Specificiteit ... 26 3.1.1 Resolutie ... 27 3.1.2 Tailing factor ... 28 3.1.3 Theoretische schotelgetal ... 29 3.2. Lineariteit en bereik ... 30 3.2.1 Calibratiecurve... 30

3.2.2 Goodness of fit test ... 32

3.2.3 Lack of fit test ... 32

3.3 Detectiegrenzen ... 33 3.4 Precisie en accuracy ... 34 3.4.1 Herhaalbaarheid ... 34 3.4.2 Intermediaire precisie ... 34 3.4.3 Recovery ... 35 3.5 Stabiliteit methode ... 35

3.5.1 Stabiliteit meetsysteem ... 36

3.5.2 Stabiliteit meetoplossingen ... 36

3.5.3 Stabiliteit mobiele fase ... 36

3.6 Stressonderzoek ... 36

4. Benodigdheden en chemicaliën ... 39

4.1 Chemicaliën ... 39

4.2 Instrumentatie & chromatografische condities ... 39

4.3 Bereiding van oplossingen ... 39

4.4 Software ... 40 5. Experimenteel ... 41 5.1 Methode ontwikkeling ... 41 5.2 Validatie ... 41 5.2.1 Specificiteit ... 41 5.2.2 Lineariteit en bereik ... 41 5.2.3 Detectielimieten ... 41 5.2.4 Precisie en accuracy ... 42 5.2.5 Stabiliteit onderzoek ... 42 5.2.6 Stress studie ... 42

5.2.7 Karakterisatie met een UHPLC-DAD-MS/MS ... 43

6. Resultaten en discussie ... 44 6.1 Methode ontwikkeling ... 44 6.2 Validatie ... 46 6.2.1 Specificiteit ... 46 6.2.2 Lineariteit... 47 6.2.3 Detectielimieten ... 48 6.2.4 Precisie en accuracy ... 49 6.3 Stabiliteit methode ... 51 6.4 Stress onderzoek ... 54 6.5 Karakterisatie UHPLC-DAD-MS/MS ... 58 7. Conclusie ... 61 8. Aanbevelingen ... 62 Referenties ... 63 Appendices ... 68

Appendix I: UHPLC-DAD condities uit literatuur ... 69

Appendix II: Chromatogrammen van literatuur en geoptimaliseerde condities ... 70

Appendix IV: Chromatogrammen van ACE onder verschillende stress condities ... 74 Appendix V:Chromatogrammen 100 vs. 6 mM ammonium formaat ... 78 Appendix VI: Relatieve voorkomen van elementen ... 79

B

EGRIPPENLIJST

Deze begrippenlijst is opgesteld ter ondersteuning voor het beschreven rapport. Gerelateerde termen zullen in het kort worden gedefinieerd

Abundantie = Relatieve aanwezigheid van elementen

Actieve farmaceutische = Werkzame bestanddelen in het geneesmiddel

ingrediënt

Adducten = Gevormde producten tussen ionen van het analyt en een

andere molecuul. (ion molecuul complex)

Alkylatie = Organische reactie waarbij een alkyl-groep aan een molecuul wordt toegevoegd

Betrouwbaarheidsinterval = Geeft aan tussen welke waardes een onderzoeksuitkomst zal zitten met een bepaalde betrouwbaarheid

Carry over = Een respons welke wordt veroorzaakt door voorgaande

analyses. Deze ontstaat wanneer er sporen achterblijven in het injectie systeem

Debiet = Hoeveelheid doorstromend mobiele fase per tijdseenheid

Degradatieproducten = Producten welke na verloop van tijd ontstaat en/of na blootstelling aan een bepaald milieu

Derivaat = Een chemische verbinding welke is afgeleid van een andere stof

Direct current = Gelijkstroom of spanning (in combinatie met R.F) welke een stabiele loop voor een specifieke m/z analyt regelt Dissociëren = Een proces waarbij een verbinding in meerdere delen splitst

Excipiëns = Het niet farmaceutisch actieve bestanddeel van een

geneesmiddel

Extrapoleren = Uitbreiding van een meetreeks met meetpunten buiten deze reeks

Fragmentatie = Het in stukken brengen van een moleculair ion Gerelateerde substanties = Achterblijvende nevenproducten van een synthese Gevoeligheid = De mate van detectie (concentratie) van een component Gradiënt = Variërende samenstelling mobiele fase volgens een bepaalde

programma tijdens de analyse

Ion pair reagentia = Additief in mobiele fase voor betere scheidingen van ionen en polaire substanties op een reversed phase kolom. Analyt wordt meer hydrofoob, waardoor affiniteit toeneemt Isocratisch = Constante samenstelling mobiele fase tijdens de analyse

Matrix = Alle componenten/excipiëns van het monster naast de

geïnteresseerde analyt

Modifiers = Een additief aan de mobiele fase waardoor er wijzigingen optreden in de methode zoals piek scherpte, etc.

Mono isotopische massa = Exacte massa van de dominerende isotoop van het element Neuroleptica = Kalmerende geneesmiddel voor behandeling van o.a.

psychosen

Onzuiverheden = Componenten welke niet in het product mag voorkomen Optische isomeren = Twee chirale moleculen, waarbij het ruimtelijk model elkaars

spiegelbeeld zijn

Precursor ion = De geselecteerde ionen uit een serie analyt ionen

Radio frequentie = Produceert een stroom waardoor er een magnetisch veld ontstaat (in combinatie met D.C voor stabiele loop van een specifieke m/z)

Reversed Phase = Techniek welke toegepast wordt voor scheidingen op polariteit. De stationaire fase is een vast materiaal, terwijl de mobiele fase vloeibaar is

Schotelhoogte = Een maat voor efficiëntie van de scheiding. Een zo laag mogelijke waarde leidt tot een betere efficiëntie

Schotelgetal = Een maat voor efficiëntie van de scheiding. Een zo hoog mogelijke waarde leidt tot een betere efficiëntie

Selectiviteit = Een methode is selectief indien de bijdragen van andere componenten worden geëlimineerd

I

NLEIDING

Acepromazine maleaat (ACE) is een actieve stof, welke vaak wordt gebruikt als verdovingsmiddel voor farmaceutische, veterinaire doeleinden. Produlab Pharma B.V. heeft verschillende oplossingen voor injectie ontwikkeld, welke naast ACE, diverse excipiëns waaronder de conserveermiddel nipagin en nipasol bevatten. Om de geïnnoveerde producten op de markt te kunnen brengen, dienen de middelen door de overheid aan de hand van een dossier goedgekeurd te worden. Hiervoor dienen de producten onder andere te voldoen aan bepaalde kwaliteit en eisen. Een gevalideerde analysemethode voor de betreffende componenten en onzuiverheden is één van de onderdelen om deze eisen te garanderen. Het dossier wordt bij het CBG1 _{ingediend. [1]}

Dit project is opgestart om een UHPLC-DAD methode te ontwikkelen met een goede resolutie en een zo kort mogelijke analysetijd om de componenten zowel te identificeren als te kwantificeren. Bekende onzuiverheden worden meegenomen tijdens de studie. De ontwikkelde methode wordt volledig gevalideerd op specificiteit, lineariteit, precisie, accuracy, detectielimieten en stabiliteit indicerend vermogen volgens de Veterinary International Conference on Harmonization (VICH)-richtlijnen. Onbekende degradatieproducten worden verder gekarakteriseerd met een triple quadrupole MS/MS.

De doelstelling is om binnen 20 weken een UHPLC-DAD methode te ontwikkelen voor de analyse op ACE, onzuiverheden, nipagin en nipasol in veterinaire farmaceutische producten. De ontwikkelde methode wordt volledig gevalideerd op specificiteit, lineariteit, precisie, accuracy, detectielimieten en de stabiliteit volgens de VICH-richtlijnen. Onbekende degradatieproducten worden met behulp van een triple quadrupole (MS-MS) verder gekarakteriseerd.

Uit eerdere studies bleek dat andere ACE formuleringen onder de juiste opslagcondities zeer stabiel waren. De betreffende monsters zullen naar verwachting stabiel zijn. Bekende onzuiverheden van ACE zijn acepromazine S-oxide (ASO), 2-acetylfenothiazine en fenothiazine. Onzuiverheden van nipagin en nipasol zoals 4-hydroxy benzoëzuur, ethyl 4-hydroxybenzoaat en butyl 4-hydroxybenzoaat kunnen voorkomen, maar worden niet geanalyseerd. Naar verwachting kan de scheiding gerealiseerd worden op een Acquity CSH-C18 (75 x 3.0 mm, 1.7 µm) kolom met variaties van chromatografische parameters. [2][3][4]

In het rapport zal er verder veel aandacht worden besteed voor het theoretische aspect van het project. De procedure met betrekking tot de registratie van nieuwe producten zal in hoofdstuk 1 besproken worden. Tevens zullen de eigenschappen en structuren van de geïnteresseerde componenten worden behandeld. In hoofdstuk 2 komen de technieken aan de orde, welke tijdens de studie zijn toegepast. Voor de specificaties en richtlijnen omtrent de validatie, wordt er naar hoofdstuk 3 verwezen. De benodigdheden en het experimentele gedeelte komen in hoofdstuk 4 en 5 ter sprake. In hoofdstuk 6 worden de gevonden resultaten bediscussieerd, waarna een conclusie in hoofdstuk 7 wordt opgemaakt. Tot slot zal er in hoofdstuk 8 enkele aanbevelingen worden beschreven voor een eventueel vervolgonderzoek. De gebruikte literatuur en de ondersteunende bijlage worden vermeldt in de hoofdstukken “referenties” en “appendices”.

1 _{Het CBG (College ter Beoordeling van Geneesmiddelen) beoordeelt en bewaakt de werkzaamheid, risico's en}

1. A

CHTERGROND

Als onderdeel van het innoveren van nieuwe farmaceutische producten, is het een vereiste om een betrouwbare, analytische methode te ontwikkelen om de kwaliteit van het product aan te kunnen tonen. Analytische methoden worden gebruikt om het actieve farmaceutische ingrediënt (API) en aanverwante verbindingen te karakteriseren. Deze methodologie vormt voor een gedeelte de basis voor het succes van de ontwikkeling van farmaceutische producten. [5]

Het CBG is de autoriteit belast met de toelating van geneesmiddelen. Dit college is verantwoordelijk voor de toelating en bewaking van humane en veterinaire geneesmiddelen op de Nederlandse markt en medeverantwoordelijk voor de toelating in de gehele Europese Unie. Van nieuwe geneesmiddelen wordt bepaald of de producten in de handel gebracht mogen worden, en of deze met of zonder recept verkocht kunnen worden. De basis voor deze beslissing is de klinische baten-risicobalans: de voordelen van het geneesmiddel moeten aantoonbaar opwegen tegen de nadelen. Na goedkeuring is er ook een blijvende geneesmiddelenbewaking om kennis verder uit te breiden. Bij diergeneesmiddelen worden voornamelijk de effectiviteit voor de te behandelen dieren en risico’s voor diezelfde dieren, de volksgezondheid en het milieu beoordeeld. [6]

De activiteit en veiligheid van het product is gerelateerd aan de API. De veiligheid kan tevens beïnvloed worden door de onzuiverheden van het actieve ingrediënt. In de farmaceutische industrie wordt getracht om de onzuiverheden te minimaliseren. Tijdens het ontwikkelen van de methode zullen de geïnnoveerde injectievloeistoffen worden gebruikt om de API, onzuiverheden en de conserveermiddelen te analyseren. De matrix verhoudingen waarmee de producten zijn geproduceerd worden met de bijbehorende concentraties in tabel 1 weergegeven. [2][7][8]

Tabel 1: Gebruikte grondstoffen met de bijbehorende concentraties in injectie oplossing 1 en 2

Ingrediënten

injectoren Concentratie injectie oplossing 1 (mg/ml) L13082904 Concentratie Injectie oplossing 2 (mg/ml) L13082906

ACE 10.0 0.5 nipagin 1.0 1.0 nipasol 0.1 0.1 Natriumchloride 5.0 5.0 Tri natriumcitraat 2.1 2.1 Water 0.998 0.998

De injectie oplossingen 1 en 2 zullen in het vervolg als respectievelijk L13082904 en L13082906 worden vermeld. De eigenschappen, functies en de onzuiverheden van ACE en de conserveermiddelen (nipagin en nipasol) worden verder in het rapport besproken.

1.1 A

ACE wordt hedendaags veelal gebruikt als werkzaam bestanddeel in sedatieve medicijnen voor diverse veterinaire doeleinden. Het is een derivaat van fenothiazine en behoort tot de farmacologische groep van de neuroleptica met een dempende werking op het zenuwstelsel. Het werkende bestanddeel bevat een verdovende functie (dosis afhankelijk), waarbij de motorische activiteit en agressie van het dier afneemt. Vijandig of rusteloos gedrag wordt op deze manier gereduceerd. Tevens kan het behandelen of transporteren van het betreffende dier op deze manier worden vereenvoudigd. [9][10]

ACE is een geel poeder, dat zowel in water als (m)ethanol oplost. Het smeltpunt van ACE varieert tussen de 136 en 139°C. De pH ligt tussen de 4.0 en 5.5 in een oplossing met water. Tevens bevat ACE geen chirale centra, waardoor er geen optische isomeren, met mogelijk andere eigenschappen, kunnen voorkomen. Het product kan gevoelig zijn voor licht en warmte. In figuur 1 wordt de structuurformule van ACE (C19H22N2OS, C4H4O4) met de bijbehorende mono isotopische massa

vertoond. [2][11]

M = 442.15625 g/mol (Acepromazine maleaat) M = 326.145294 g/mol (Acepromazine)

Figuur 1: Structuurformule ACE met de mono isotopische massa van ACE en acepromazine [12][13] Eerdere studies beschouwen ACE als een niet toxisch product. De LD50 van deze stof is vastgesteld op

270 mg/kg (orale route). Wel kunnen er ademhalingsproblemen en hypnotiserende effecten ontstaan. Mogelijke sporen van onzuiverheden welke tijdens of na de synthese van ACE kunnen ontstaan zijn 2-acetylfenothiazine, fenothiazine en ASO. De structuurformules van deze onzuiverheden worden met de bijbehorende mono isotopische massa weergegeven in figuur 2. Deze bekende onzuiverheden kunnen eventueel in het eindproduct voorkomen. [2][14]

2-Acetylfenothiazine ASO Fenothiazine

C14H11NOS C19H22N2O2S C12H9NS

M = 241.056137g/mol M = 342.4575g/mol M = 199.045563 g/mol

Figuur 2: Chemische structuren en de mono isotopische massa van de onzuiverheden: 2-acetylfenothiazine, fenothiazine en ASO [2][13]

De limieten van zowel de bekende als onbekende onzuiverheden zijn vastgesteld op maximaal 0.5% ten opzichte van ACE. Gezamenlijk mogen de onzuiverheden niet meer dan 1.0% bevatten. Deze richtlijnen zijn vastgesteld door de VICH. [15][16]

Eerdere studies bevestigden dat ACE als “droog” poeder een stabiele component is, waarbij er na 6 jaar geen enkele degradatie optreedt onder normale omstandigheden. Tevens werden er geforceerde degradatiestudies uitgevoerd, waarbij ACE (opgelost) aan verschillende stress condities werd blootgesteld. Onder zure, basische en thermische omstandigheden was er geen sprake van afbraak. Door blootstelling aan oxidatieve condities werd ACE volledig gedegradeerd tot ASO. Het stressen met zonlicht (lux)2 _{en UV-condities (watt)}3 _{versnelde de vorming van ASO.[2][12]}

1.2 N

&

Nipagin (methyl hydroxybenzoaat) en nipasol (propyl hydroxybenzoaat) zijn alkylesters van 4-hydroxybenzoëzuur en worden veelal in de veterinaire farmacie gebruikt als conserveermiddel. Beide hebben een antibacteriële en een antischimmel-werking om microbiologische (mogelijk resulterend in toxische) groei te voorkomen. Deze componenten behoren tot de parabenen en worden al meer dan 70 jaar toegepast. Beide componenten moeten in een zo laag mogelijke concentraties aanwezig zijn om allergische symptomen te voorkomen. De componenten zijn actief in een pH gebied tussen de 4 en 8. De reden voor de aanwezigheid van beide ingrediënten, is om gedurende het gebruik, potentiele groei van bacteriën en schimmels te voorkomen. Nipagin heeft bijvoorbeeld een zwakke activiteit op een specifieke bacterie, terwijl nipasol een sterke activiteit hierop kan uitoefenen. Zowel nipagin als nipasol lossen matig op in water en goed in ethanol. De chemische eigenschappen van beide componenten worden samengevat in tabel 2. [17][18][19]

Tabel 2: Chemische eigenschappen van nipagin en nipasol

Eigenschap Nipagin Nipasol

Moleculeformule C8H8O3 C10H12O3 Molmassa (g/mol) 152.15 180.20 Smeltpunt (°C) 125-128 95-98 Kookpunt (°C) 298.6 133 Dichtheid (g/cm3_{) 1.46 1.06} Structuurformule

2_{Lux condities: zichtbaar licht welke tussen 400-800 nm varieert uitgedrukt in lux-uren}

Het gebruik van deze parabenen als conserveermiddel leiden tot de volgende voordelen [39]:

• Breed spectrum van activiteit tegen verschillende bacteriën (gram positieve/negatieve typen) en schimmels in eindproducten

• Effectief in lage concentraties • Weinig tot geen toxiciteit • Stabiel over een brede pH bereik • Biodegradeerbaar

• Acceptabel en toegestaan in veel producten • Goedkoop

Beide componenten zijn zeer stabiel onder normale omstandigheden. Blootstelling aan oxidatieve en basische condities kunnen wel degradatieproducten creëren. Tevens kunnen nipagin en nipasol onzuiverheden bevatten die tijdens de synthese zijn ontstaan. Bekende onzuiverheden die hypothetisch kunnen voorkomen, zijn in figuur 3 geïllustreerd.[3][4][20][21]

4-hydroxy benzoëzuur ethyl 4-hydroxybenzoaat butyl 4-hydroxybenzoaat

M = 138.12g/mol M = 166.18g/mol M = 194.23g/mol

Figuur 3: Structuurformules en de molaire massa van hydroxy benzoëzuur, ethyl 4-hydroxybenzoaat en butyl 4-4-hydroxybenzoaat [3][4]

In de meeste formuleringen zijn de concentraties van nipagin en nipasol in het eindproduct relatief laag. Registratie technisch bekeken, is het geen vereiste om de onzuiverheden van de conserveermiddelen aan te tonen, mits deze niet als toxisch worden aangemerkt.[3][4]

2. T

ECHNIEKEN

De methode ontwikkeling van ACE werd uitgevoerd met een UHPLC gekoppeld aan een diode array detector. Bij het karakteriseren van de onbekende onzuiverheden werd er gebruik gemaakt van een triple quadrupole massaspectrometer. Beide technieken zullen uitgebreid besproken worden.

2.1 U

H

P

L

C

Vloeistofchromatografie wordt veel toegepast in de farmaceutische industrie. De meest gebruikte techniek is de high performance liquid chromatography (HPLC). Hoewel de HPLC een zeer betrouwbare techniek is, zal er altijd ruimte zijn voor verbeteringen. Een geavanceerdere scheidingstechniek is de ultra high performance liquid chromatography (UHPLC), waarbij de hoge druk (15000 psi ≈ 1000 bar) van het systeem en de deeltjesgrootte van de kolom fundamenteel zijn. Een kleinere deeltjesgrootte van de kolom biedt een betere resolutie op de scheiding. Tevens wordt de analysetijd gereduceerd, waardoor analytische resultaten in een kortere tijd verkregen kunnen worden. Hiermee kunnen kosten bespaard worden. [22][23]

Het principe van de UHPLC verschilt niet ten opzichte van de HPLC, met als uitzondering de hoge drukcapaciteit. Via een pomp wordt de mobiele fase (gradiënt of isocratisch) naar de injectiepoort geleid. Vervolgens zal deze oplossing de gekozen kolom passeren. Hier zullen de componenten worden gescheiden op basis van affiniteit. Componenten vertonen retentie vanwege de (a)polaire eigenschappen die zij beschikken. Na de scheiding zal de detector de respons waarnemen en deze in de vorm van een chromatogram weergegeven. In figuur 4 is er een schematische weergave afgebeeld met betrekking tot het principe van deze techniek. [22][23]

Figuur 4: Schematische weergave van de (U)HPLC techniek [24]

Door de hoge sensitiviteit, resolutie en reducerende kosten is de UHPLC een zeer interessante scheidingstechniek in de farmaceutische industrie. Een nadeel is dat de UHPLC tot 1000 bar kan opereren, waardoor de onderhoudskosten toe kunnen nemen. Tevens hebben kolommen met partikeldeeltjes van 1.7 µm een lagere levensduur, doordat deze niet regenereerbaar zijn. [22]

2.1.1 Van Deemter vergelijking

De onderliggende principe van deze evolutie wordt beheerst volgens de “van Deemter vergelijking”. Deze formule beschrijft de relatie tussen de lineaire snelheid en de schotelhoogte, waardoor piekverbreding kan ontstaan. Men streeft naar een zo laag mogelijke schotelhoogte. Hoe lager het getal, des te beter de scheidingsefficiëntie. De schotelhoogte wordt beïnvloed door verschillende variabelen. In figuur 5 en vergelijking 1 wordt een samenhang van de gerelateerde variabelen weergegeven. [25][26] u C u B A H = + + ⋅ (1) Waarbij: A = Eddy diffusie B = Longitudinale diffusie

C = Weerstand van massa overdracht

u = Lineaire snelheid (cm/sec)

Figuur 5: Van Deemter vergelijking met de bijbehorende invloed factoren waarbij piekverbreding wordt veroorzaakt [25]

De Eddy-diffusie (figuur 6) is een constante, welke gedefinieerd wordt als de manier van doorlaatbaarheid van het eluens door de kolom. Hoe kleiner de pakkingsgrootte, hoe lager de Eddy-diffusie en de schotelhoogte zal zijn. De doorlaatbaarheid van de mobiele fase zal makkelijker verlopen, waardoor er minder retentie op zal treden in de vorm van piekverbreding. Om de scheidingsefficiëntie volledig te verkrijgen is er een kolom nodig, waarvan de deeltjesgrootte kleiner is dan 2µm. [25] [26]

Figuur 6: Eddy-diffusie [25] De longitudinale diffusie (figuur 7) houdt rekening met het

feit dat er diffusie optreedt vanuit zones met een hoge concentratie, naar zones met een lage concentratie. De B-term is onafhankelijk van de deeltjesgrootte, welke indiceert dat wanneer de flow afneemt, er een grotere kans bestaat dat piekverbreding ontstaat. Analyten hechten zich langer aan de kolom. Omgekeerd, zal er bij een toename van de flow, minder tijd zijn voor een diffusie. Hierdoor is er een kleinere kans op

Figuur 8: Massa overdracht [27]

Tot slot wordt de massaoverdracht (figuur 8) beïnvloed door de flow en deeltjesgrootte. De populatie met analyten worden van de mobiele fase naar de poriën van de stationaire fase getransporteerd. Deze zullen na de interactie naar het eluens terugkeren. Omdat de diepte van de poriën verschillend zijn, zullen de moleculen ieder een andere afstand afleggen. Dit kan resulteren tot een spreiding van de analytische band. De mate van spreiding is afhankelijk van de snelheid van de mobiele fase. Tijdens de transport van de analyten, zullen moleculen hechten aan de poriën van de stationaire fase. Andere moleculen zullen verder elueren totdat deze aan een andere partikeldeel kunnen hechten. Bij een hoge flow zal de variatie tussen de interactietijd van de moleculen veel groter zijn. Hoe sneller de elutiesnelheid, des te eerder de moleculen door de kolom transporteren. Dit resulteert tot een bredere en minder geconcentreerde piek. De massa overdracht zal optimaal worden wanneer de deeltjesgrootte afneemt. Hoe kleiner de partikeldeeltjes, des te minder tijd de moleculen nodig hebben voor het transport in de poriën. [22][26][28][29][30]

2.1.2 Pomp

Ten opzichte van de conventionele HPLC, is het noodzakelijk om een over een pomp te beschikken, welke een goede weerstand kan bieden tegen de hoge druk van de UHPLC. Tijdens het onderzoek wordt een dubbele plunjer model van Shimadzu gebruikt. De elutiesnelheid heeft een bereik van 0,0001 t/m 3,0000 milliliter per minuut tijdens een injectie, waarbij 10,000 milliliter per minuut het hoogst haalbare is. Deze ultra hoge capaciteit geeft de mogelijkheid om op kolommen met microdeeltjes te elueren. Een tweede voordeel is dat er door de dubbele pomp een constante flow wordt gegenereerd. De aandrijving van beide pompen worden door dezelfde motor gerealiseerd. De ene plunjer kan het pompen realiseren, waarbij de andere plunjer kan navullen. Het proces resulteert tot het niet overlappen van beide flow-profielen, waardoor fluctuering van de flow wordt gereduceerd. [31][32][33]

2.1.3 Sample injector

Bij UHPLC is de injectie van het monster van groot belang. Conventionele injectiepoorten zijn niet geschikt voor de extreme druk van de UHPLC. Om de kolom tegen extreme druk fluctuaties te beschermen, moet het injectieproces drukvrij zijn. De omvang van de injectiepoort moet tevens minimaal zijn om potentiële piekverbreding te voorkomen. Een snelle injectie cyclus is nodig om volledig van de snelheid te profiteren, welke de UHPLC kan bieden. Dispersie van het monster kan gereduceerd worden door de afstand tussen de injectiepoort en de injectieklep te verkleinen. [22]

2.1.4 Kolom

Kleinere partikeldeeltjes kunnen de massa transfer reduceren. De helling van de C-term neemt af, waarbij een lagere schotelhoogte (H) wordt verkregen. Hiermee wordt tevens bedoeld dat het bereik van de lineaire snelheid toeneemt, waardoor een betere sensitiviteit en resolutie mogelijk wordt gemaakt. De relatie tussen de deeltjesgrootte van de kolom en de “van Deemter vergelijking” wordt in figuur 9 worden weergegeven. [26]

Figuur 9: Invloed deeltjesgrootte kolom op de van Deemter vergelijking [74]

De keuze van een UHPLC kolom is afhankelijk van de polariteit van de componenten. ACE kan op polariteit worden gescheiden, waardoor er werd gekozen om “Reversed Phase” toe te passen. De voorgestelde kolom bevat een apolair oppervlak (gemodificeerde silica met een lange koolstofketen). Door interactie met ACE zal er vervolgens retentie ontstaat.

De interne diameter (ID) van een kolom is een belangrijke aspect, welke de sensitiviteit en de scheiding van de component kan beïnvloeden. Tevens beïnvloed het de capaciteit van het injectievolume, welke op de kolom geïnjecteerd kan worden. Hoe kleiner de ID, hoe minder er gebruik gemaakt wordt van de mobiele fase, waarbij kosten kunnen worden bespaard. Een kleinere ID heeft als nadeel dat er eerder fronting op kan treden. Een grotere ID heeft een ruimere capaciteit,

waarbij er een grotere volume geïnjecteerd kan worden. Als gevolg hiervan is de grotere kans op toename van piekverbreding. [11][34][35][36][37]

Tevens is de lengte van de kolom van belang. Een langere kolomlengte zal voor een betere scheiding zorgen, maar behoeft een langere analysetijd. Omgekeerd, bij een kortere kolom, zal de scheidingstijd afnemen, wat leidt tot een slechtere resolutie. Men spreekt van een ratio tussen de lengte van de kolom en de pakkinggrootte (L/dp). Hoe hoger deze ratio, des te hoger het schotelgetal. Een C18 wordt vaak geadviseerd als startkolom, omdat de gebonden fase de meeste interactie kan vertonen tussen polaire en apolaire analyten. Door de samenhang van de verschillende factoren, is tijdens het project de keuze gevallen op een kolom van Waters. Het is een C18- kolom met een lengte en diameter van respectievelijk 75 en 3 mm. De deeltjesgrootte van de kolom is 1.7 µm.[26][30][38]

2.1.5 Diode array detector

Na de scheidingen van de componenten zal het signaal omgezet worden in de vorm van een chromatogram. Er wordt gebruik gemaakt van een diode array detector (DAD). Een DAD kan een spectrum over alle golflengten opnemen. Het voordeel hiervan is dat de gevoeligste analyselijn geselecteerd kan worden tijdens de methode ontwikkeling. De maximale absorptie zal vervolgens getoond worden. [39]

Met behulp van een deuteriumlamp zal er een polychromatisch licht ontstaan. Dit zal vervolgens het monster passeren en het licht zal door een rooster worden gereflecteerd, waardoor er een spectrum ontstaat. Het spectrum zal door verschillende diodes in elektrische signalen worden omgezet. Het golflengtesignaal wordt samen met de retentietijd in een chromatogram uitgedrukt, waardoor er een driedimensionaal plaatje ontstaat. In figuur 10 staat het principe van de diode array detector weergegeven met daarbij het driedimensionale spectrum. [39]

Figuur 10: Principe diode array detector met de bijbehorende 3D-spectrum [39]

Een driedimensionaal chromatogram kan tot vele voordelen leiden. Naast het identificeren van een analyt, kan de zuiverheid van een stof gecontroleerd worden. Een mogelijke nadeel is dat labiele monsters door het polychromatische ligt kan degraderen. [39][40]

2.2

M

Om onbekende onzuiverheden te karakteriseren zal er gebruik worden gemaakt van massaspectrometrie (MS). Dit is een analytische techniek om geladen ionen op basis van massa en lading (m/z) te scheiden onder invloed van een magnetisch veld. De relatieve massa’s van het moleculair ion en fragmenten kunnen gedetermineerd worden, waarna informatie over de structuur van het molecuul wordt bewerkstelligd. In de farmaceutische industrie is deze krachtige analysetechniek van belang om (on)bekende onzuiverheden zowel te karakteriseren als te kwantificeren op een laag niveau. Verschillende types massaspectrometers zijn ontwikkeld voor de keuze van de toepassingen. Er zijn 3 typen MS welke wereldwijd worden toegepast in de farmaceutische industrie: (single/triple) quadrupoles, ion trap en de time of flights (TOF). Voor- en nadelen zijn geassocieerd met de toepassingen en prijzen van het instrument. Tijdens de studie werd de UHPLC-DAD gekoppeld aan een triple quadrupole (Typenummer LCMS-8040) van Shimadzu. De instrumentatie wordt geïllustreerd in figuur 11.

Figuur 11: Triple quadrupole LCMS-8040 systeem van Shimadzu

Om componenten na de UHPLC te detecteren aan de hand van massa spectrometrie, moeten deze eerst geïoniseerd worden. Een bekende ionisatiebron is de atmospheric pressure ionization (APIO). Men kan de onderverdeling maken in atmospheric pressure chemical ionization (APCI) en

electrospray ionization (ESI). Beide ionisatiebronnen worden vaak toegepast in combinatie met

vloeistofchromatografie (LC). Tijdens het project wordt er gebruik gemaakt van de ESI. Het principe, de voor- en nadelen van deze ionisatiebron worden verder in het rapport beschreven. [41][42][43][44]

2.2.1 Electro Spray Ionisatie

Het gebruik van een ESI kan tot enkele voordelen leiden. Ten eerste kunnen grote moleculen in meervoudige ionen worden gevormd, waarbij het massabereik evenredig toeneemt met de lading van de ionen. Ten tweede vereist ESI dat de analyten zijn opgelost in een vloeistof. In tegenstelling tot andere ionisatietechnieken, vereist het geen “exotische” vloeistoffen. Oplosmiddelen als water, methanol en acetonitril kunnen gebruikt worden, wat maakt dat de ESI-MS een geschikt

detectiemiddel is in combinatie met een LC. Een nadeel van de ESI is het kunnen ontstaan van ion suppressie, welke door matrixeffecten als zouten en buffers wordt veroorzaakt. Er ontstaat dan een competitie om het aantal beschikbare plaatsen aan het oppervlak van de druppeltjes tussen analyt- en bufferionen. De ESI (figuur 12) is een ionisatietechniek waarbij aanwezige ionen in een vloeistof tot de gasfase wordt gebracht. [42][43]

Figuur 12: Principe van de ESI ionisatiebron [43]

Het analyt wordt via een capillair, onder een potentiaal verschil (3 tot 5 kV), in de ionisatiebron gebracht. Onder invloed van de atmosferische druk en een elektrisch veld wordt de analyt tot een spray van geladen vloeistofdruppeltjes verneveld. Deze druppels zullen in het vervolg verder worden verdampt door een verwarmd gas, waardoor de concentratie van het geladen vloeistof toeneemt. Doordat de oplosmiddeldruppels verdampen, zullen de positieve ladingen dichterbij elkaar komen, waardoor er een afstotende kracht zal ontstaan. De druppels zijn instabiel wat leidt tot het uiteenvallen in een aantal kleinere deeltjes. Dit proces heet de coulomb explosie en kan zich een aantal malen herhalen totdat de ionen uit de druppeltjes kunnen ontsnappen en in de gasfase terecht komt. De geïoniseerde moleculen kunnen op dit moment adducten vormen met andere aanwezige ionen zoals de mobiele fase. Tevens kan het voorkomen dat er geen positieve ionen ontstaan door de eigenschappen van het betreffende molecuul. Men kan daarom het potentiaal zodanig instellen, dat de gevormde druppeltjes negatief worden geladen. De ionen in de gasfase zullen zich onder invloed van een elektrisch veld in de richting van de MS bewegen, waar het vervolgens op basis van massa/lading van elkaar wordt gescheiden. [42][43]

2.2.2 Triple Quadrupole MS/MS

Het scheiden van de ionen werd tijdens het project verricht op een triple quadrupole tandem massa spectrometer (MS/MS). Dit instrument bestaat uit drie verschillende quadrupolen met ieder een eigen functie. Elke quadrupole bevat vier paar staven, welke als tegenpolen zijn geladen en in de vorm van een kubus geordend zijn. De eerste quadrupole (Q1) wordt de geïnteresseerde precursor

ion geselecteerd. Door de verhouding radio frequency (RF) en direct current (DF) zodanig in te stellen,

kan een quadrupole als een massa filter fungeren. Een elektrisch veld wordt gecreëerd, waarbij moleculen uit de ionenbron opeenvolgend van lage m/z naar hoge m/z waarde naar de detector gestuurd worden. In de tweede quadrupole (Q2) wordt de techniek Collision Induced Dissociation (CID) toegepast. Hierbij botsen de geselecteerde ionen met een collisiegas (meestal stikstof), waarbij de kinetische energie van de ionen tot interne energie wordt omgezet. De overmaat interne energie in de ionen kunnen vervolgens leiden tot fragmentatie. De keuze in welke ionen en de hoeveelheid hiervan is gebaseerd op de sterkte van het elektrische veld. Tot slot zal de derde quadrupole (Q3) hetzelfde fungeren als Q1. Geselecteerde fragmentionen worden gescheiden en doorgelaten voor de detectie. Het principe zal in figuur 13 worden geïllustreerd. [42][45]

Figuur 13: Principe van een triple quadrupole MS/MS [43]

Triple quadrupolen kunnen evenals single quadrupoles een Total Ion Scan (TIC) en een Selected Ion

Monitoring (SIM) uitvoeren. Bij een TIC worden de massa’s weergegeven van alle ionen, terwijl er

tijdens de SIM mode de Q1 wordt ingesteld op één specifieke massa. Hierdoor is een SIM veel specifieker dan de TIC. Bij een triple quadrupole is er tevens de mogelijkheid om een product ion scan (PIS) of een Multi reaction monitoring (MRM)4 _{uit te voeren. Bij een PIS worden de in Q1}

geselecteerde ion(en) gedissocieerd, waarna alle productionen gescand worden. Voor een MRM zal Q1 en Q3 zodanig ingesteld worden, dat enkel specifieke geselecteerde ionen worden toegelaten. Dit kan echter alleen wanneer de eigenschappen van het analyt, zoals de fragmentatie, gekend zijn. Een voordeel van deze mode is de verhoging van de selectiviteit. In figuur 14 worden de verschillende scan modes overzichtelijk weergegeven. [42][44][46][47]

Figuur 14: Overzicht verschillende scan modes van een triple quadrupole

2.2.3 Koppeling UHPLC-ESI-MS/MS

De combinatie UHPLC met een ESI-MS/MS is een krachtige analysetechniek. Niet elke UHPLC-methode die ontwikkeld is voor het gebruik met een detectietechniek als DAD, kan zonder enige aanpassingen in combinatie met ESI-MS/MS gebruikt worden. Enkele randvoorwaarden zullen aan de orde komen [42].

1. Niet vluchtige buffers zoals fosfaten mogen niet gebruikt worden in verband met de permanente vervuiling van de MS.

2. Vluchtige buffers mogen wel gebruikt worden, indien de concentratie niet te hoog is. De elektrische geleidbaarheid kan afnemen, waardoor er geen electrospray gevormd kan worden. Tevens neemt de gevoeligheid af door het ontstaan van ion suppressie, welke eerder in het rapport werd besproken. De maximale concentratie hangt af van het soort buffer en de pH en ligt rond de 5 tot 10 mmol/L.

3. Amine modifiers mogen niet gebruikt worden. Deze modifiers komen eerder in de gasfase in verhouding tot base analyten. Hierdoor worden de te analyseren analyten weggedrukt, waardoor niet of slecht waarneembaar worden.

4. Niet vluchtige ion pair reagentia mogen niet gebruikt worden. Vluchtige, zoals trifluorazijnzuur (TFA), kunnen wel worden toegepast. Echter kan het invloed uitoefenen op de gevoeligheid en stabiliteit van de electrospray, doordat er geen neutrale ionen van de vloeistof naar gasfase kan gaan.

Enkele implicaties kunnen belangrijk zijn voor de ESI-MS/MS proces. Men kan het eluens bijvoorbeeld na de kolom splitsen, waardoor er maar een deel in de ionisatiebron terecht komt. De gevoeligheid neemt toe wanneer het debiet van de mobiele fase afneemt. Tevens zal er minder vervuiling optreden in de massaspectrometer, als er minder eluens doorstroomt. Een afname van de inwendige diameter (ID) van de kolom kan een positieve gevolg hebben op de gevoeligheid van het proces. [42]

Literatuurstudies werden uitgevoerd met betrekking tot de instrumentaties en instellingen voor de ontwikkeling van een UHPLC-DAD methode. Geschikte methodes uit verschillende studies werden samengevat en als startreferentie gebruikt tijdens de methodeontwikkeling (zie appendix I). De methode werd vervolgens geoptimaliseerd door variatie van de mobiele fase, flow, injectievolume en kolomtemperatuur, waarna het proces op verschillende kerngrootheden werd gevalideerd.

Praktische optimalisering voor de massaspectrometer werden uitgevoerd op de selectie van ionen, de energie voor fragmentatie en de spanning voor het elektrische veld voor Q1 en Q3. De procedure van de MS analyse werd niet gevalideerd na overleg met Produlab Pharma. [48][49]

3. V

ALIDATIE

Het valideren van een methode verloopt volgens een bepaalde proces, waarbij een analytische procedure wordt getest op kerngrootheden. De resultaten van de methode validatie kunnen een oordeel geven over de kwaliteit van de methode. De validatie is pas compleet wanneer deze aan de gestelde eisen voldoet. In tabel 3 worden de geteste validatiepunten op de componenten en onzuiverheden met de bijbehorende criteria weergegeven. Deze zijn via verschillende literatuurstudies en in overleg met Produlab Pharma vastgesteld. [50][51][52][53][54]

Tabel 3: Validatiepunten op componenten en onzuiverheden met de gestelde criteria [50][51][53]

Validatiepunten Onzuiverheden Componenten

Testen Criteria Testen Criteria Specificiteit + Resolutie >2.0 Tailing factor 0.9-1.5 Schotels >3000 + Resolutie >1.5 Tailing factor 0.9-1.5 Schotels >3000 Lineariteit en bereik + R>0.980 + R>0.995

Limit of detection + Geen + Geen

Limit of quantitation + Geen + Geen

Herhaalbaarheid + RSD<10% + RSD<2.0%

Intermediaire precisie + RSD<10% + RSD<2.0%

Recovery + 90-110% + 95-105%

Stabiliteit systeem - Geen + <5.0%

Stabiliteit meetoplossingen - Geen + <5.0%

Stabiliteit mobiele fase - Geen + <5.0%

Stress onderzoek - Geen + Geen

De validatiepunten worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de VICH. Dit is een organisatie in de veterinaire farmaceutische industrie, welke aanbevelingen en regelgeving op productontwikkelingen beschrijft voor Europa, Amerika en Japan. Op deze manier wordt dezelfde regelgeving op harmonieuze wijze gehanteerd binnen veterinaire farmaceutische studies. Tijdens het project werd alleen de validatie op de hoofdcomponenten uitgevoerd. De validatie van de onzuiverheden werden tijdens de studie met een “responsfactor” verklaard. In hoofdstuk 3.6 zal deze factor worden besproken. [50][52][53][54]

3.1

S

De specificiteit van een methode is de aantoning van de respons, welke specifiek door een component wordt veroorzaakt. Een analysemethode is specifiek wanneer het in staat is de component te onderscheiden van alle andere verbindingen die kunnen voorkomen in het monster. Zowel aanwezige als mogelijk te verwachten componenten worden aangetoond. Voorbeelden van verwachte componenten zijn bekende onzuiverheden van ACE. De specificiteit van aanwezige componenten wordt bewerkstelligt door analyses op de standaarden van ACE, nipagin, nipasol en de bekende onzuiverheden. De chromatogrammen worden vervolgens beoordeeld op verschillende kerngrootheden met betrekking tot de scheiding. Voorbeelden hiervan is de resolutie, tailing factor en het theoretisch schotelgetal. In de volgende paragrafen worden deze factoren besproken. De analyse van “gestreste materialen” vormt tevens een onderdeel van de specificiteit (zie hoofdstuk 3.6). [9]

3.1.1 Resolutie

De resolutie is een maat om het scheidend vermogen te bepalen tussen twee pieken. Het begin en einde van de betreffende piek staan samen met de basislijn centraal om de resolutie te bepalen. Wanneer het signaal van de betreffende piek afneemt, zal deze op de basislijn moeten terugkeren, waarna de volgende piek geregistreerd kan worden. De mate van scheiding tussen deze twee pieken wordt de resolutie genoemd. Deze is met vergelijking 2 te berekenen. [55]

𝑅 = 2𝑥𝑇𝑟−𝑇𝑟𝑝_{𝑊+𝑊𝑝} (2)

Waarbij:

Tr = Retentietijd laatste eluerende piek (min)

Trp = Retentietijd vorige piek (min)

W = Piekbreedte laatste eluerende piek (min) Wp = Piekbreedte vorige piek (min)

Een resolutie van 1.0 indiceert een scheiding van 98% tussen twee pieken. Een scheiding van 100% tussen twee goed gevormde pieken heeft een resolutie van >1.5. Men noemt het een scheiding op de basislijn. Figuur 15 laat scheidingen zien tussen twee pieken met verschillende resoluties. De vereisten van de resolutie met betrekking tot de pieken zijn vaak groter dan 1.5. In de meeste gevallen wordt het doel gesteld op een zo kort mogelijke analysetijd met genoeg scheidingscapaciteiten. [53][56][57]

3.1.2 Tailing factor

In de praktische chromatografie zijn perfecte, symmetrische pieken zeer zeldzaam. Het komt veel vaker voor dat er pieken worden waargenomen met een tailing. Het latere deel van de geëlueerde piek is ten opzichte van het eerdere deel veel wijder. Dit kan resulteren tot piekverbreding. Omdat piek-tailing de kwaliteit van de scheiding kan beïnvloeden, wordt er aandacht besteed aan de tailing factor. Een wederzijdse piekvorm wordt fronting genoemd. Omdat het in een mindere mate voorkomt dan tailing, zal deze niet besproken worden. Beide piekvormen worden samen met een symmetrische piek in figuur 16 geïllustreerd. [56][57][58]

Figuur 16: Voorbeelden verschillende piekvormen; symmetrisch, fronting en tailing [57]

Verschillende factoren kunnen leiden tot asymmetrische pieken. Een C18 kolom bestaat bijvoorbeeld nagenoeg geheel uit C18 materiaal en is puur hydrofoob. Echter is een deel van het silica oppervlakte ongebonden, waardoor de silanol (Si-OH) groepen achterblijven voor interactie met het analyt. Wanneer deze silanol groepen naast elkaar staan gepositioneerd, kunnen deze protonen aan elkaar afstaan. De vrije silanol groepen zijn veel zuurder, waardoor het een veel sterkere interactie met basische moleculen heeft. Dit resulteert tot een piek tailing op basis van scheiding van basische analyten. Ter preventie kan tri-ethylamine (TEA) gebruikt worden als additief in de mobiele fase. TEA fungeert als een competitieve base, waardoor

de aantal silanol groepen gereduceerd kan worden. Echter is het niet gewenst om TEA als additief te gebruiken in verband met contaminatie van de kolom. Als alternatieve oplossing voor het probleem kan er gebruik worden gemaakt van een kolom met een hoge zuiverheidsgraad. Andere oorzaken van

tailing zijn contaminaties op de kolomoppervlakte of extreme concentraties van de analyt. Met behulp van de tailing factor (TF), welke in vergelijking 3 wordt vermeld, kan de symmetrie van elke individuele piek geïndiceerd worden. In figuur 17 worden de variabelen geïllustreerd.

𝑇𝑓 =𝑊0.05_2𝑑 (3)

Waarbij:

W0.05 = Breedte van de piek op 5% van de piekhoogte

d = Afstand tussen het begin tot het midden van de piek op 5% van de piekhoogte

De ideale piekvorm heeft een TF van 1.0, wat correspondeert met een perfecte symmetrische piek. Indien de TF kleiner is dan 1.0, wordt de piek beschreven als fronting. Wanneer de TF groter is dan 1.0, is er sprake van tailing van de piek. Acceptabele criteria voor de TF is tussen de 0.9 en 1.5. [56]

3.1.3 Theoretische schotelgetal

De efficiëntie van een chromatografische piek is een meting naar de bandbreedte van de analyt. Zowel het systeem als de kolom zijn oorzaken van piekverbredingen. Het theoretische schotelgetal (N) is een maat om deze dispersie te bepalen. Het is een dimensieloos getal en verwijst naar de kinetiek van de chromatografische retentiemechanisme. De aantal schotels kan bepaald worden met vergelijking 4. De ondersteunende variabelen worden in figuur 18 weergegeven.

Een hogere schotelgetal geeft een betere efficiëntie. Een toename van het schotelgetal kan bewerkstelligd worden door veranderingen aan de lengte en deeltjesgrootte van de kolom, de flow en eventuele systeemonderdelen. De criteria voor het schotelgetal is vastgesteld op >3000. [56][63]

Figuur 18: Theoretische schotelgetal van een piek [56]

𝑁 = 5.54(_𝑊ℎ𝑇𝑟)2 ₍₄₎

Waarbij

Tr =Retentietijd op de maximum respons van de piek Wh =Breedte op 50% van de hoogte van de piek

3.2.

L

Een lineair verband is noodzakelijk in een gevalideerd methode en moet binnen het bereik worden geëvalueerd. De concentratie van de te bepalen component moet het liefst lineair overeenkomen met de respons. Om de lineariteit te bepalen, wordt er in de spectrometrie de Wet van Lambert Beer toegepast. Statistische methodes op de regressie en kwadratensommen worden toegepast om de mate van de lineariteit te bepalen. De helling, asafsnede en de correlatiecoëfficiënt worden samen met de kwadratensom bepaald bij een betrouwbaarheidsinterval van 95%. Verder kan een Goodness Of Fit-test (GOF) worden uitgevoerd om vast te stellen of de parameters van het model de variatie in de meetwaarden wel of niet goed verklaren. Met de Lack Of Fit-test (LOF) kan er vervolgens worden vastgesteld of het model adequaat is ten opzichte van de gemeten data. Zowel de GOF als de LOF worden uitgevoerd bij een betrouwbaarheidsinterval van 95%. [50][54][64][65]

3.2.1 Calibratiecurve

Instrumentele calibratie is een essentiële punt voor een valide methode. Standaarden met een bekende concentratie worden bereid. Concentraties van deze standaarden worden tegenover het instrumentele respons uitgezet, waarbij er een regressie ontstaat. Op basis van deze relatie kan de concentratie van het monster bepaald worden. Het doel van de lineaire regressie is om de relatie te beschrijven tussen concentratie niveau (x) en de instrumentele respons (y). Tijdens het project staat de lineariteit, welke overeenkomt met een 1e_{graads model. Deze wordt berekend als: Y=b1x+b0,}

waarbij b1 de helling beschrijft en b0 de asafsnede van de y-as. De opzet wordt uitgevoerd via de kleinste

kwadratenmethode. Elke meetresponsie (Yi), welke door de opzet van de kalibratielijn werd gebruikt, kan via het model een geschatte responsie (Ygeschat) worden berekend. Het verschil tussen de gemeten en geschatte responsie wordt een residu genoemd. De kwadratensom van alle residuen worden opgeteld. De beste lijn (figuur 19) wordt verkregen indien de som van de kwadraten van alle residuen minimaal is. Het minimaliseren verloopt via een differentiatieproces, waarna vervolgens de richtingscoëfficiënt

en asafsnede uit wordt bepaald. [64][66] Figuur 19: Kleinste kwadratenmethode – berekening van de beste lineaire lijn [66]

De richtingscoëfficiënt van een methode is de mate waarin het toelaat om kleine veranderingen in de concentratie op betrouwbare wijze te meten. De asafsnede is het snijpunt op de Y-as. Deze kunnen berekend worden met vergelijking 5 en 6. [64]

Richtingscoëf�iciënt (B1) =Sxy_Sxx (5)

Asafsnede (B0) = Ygemiddelde − B1 ∗ Xgemiddelde (6) Waarbij:

Sxy = Som van Xi–Xgemiddelde vermenigvuldigend met Yi–Ygemiddelde Sxx = Kwadratensom van Xi – Xgemiddelde

Syy = Kwadratensom van Yi – Ygemiddelde (nodig voor berekening richtingscoëfficiënt) Ygemiddelde = Gemiddelde gemeten responsie van alle standaarden

Xgemiddelde = Gemiddelde concentratie van alle standaarden

Om een indicatie te geven over de betrouwbaarheid van de berekende richtingscoëfficiënt en de asafsnede, zal de spreiding hiervan bepaald worden. De berekeningen zullen uitgevoerd worden bij een betrouwbaarheidsinterval van 95%. In de relaties die daarvoor gelden, komt steeds de standaarddeviatie van de residuen (Sr) voor. Deze berekening zal samen met de bijbehorende spreidingen van de richtingscoëfficiënt en de asafsnede in vergelijking 7, 8 en 9 worden vermeld.

Sr = �SSres_n−p (7)

B0 (BI95%) = ±t ∗ Sr ∗ �1_n+(Xgemiddelde)2_Sxx (8)

B1 (BI95%) = ±t ∗ Sr ∗ �_Sxx1 (9)

Waarbij:

SSres = Kwadratensom van de afwijking van de meetwaarde ten opzichte van de geschatte respons n = Aantal standaarden

p = Aantal parameters van het model (B0 en B1)

t = Statistisch getal voor n-p (zie t-tabel bij 95% betrouwbaarheidsinterval: t =2.26)

De waarde 0 moet binnen het berekende betrouwbaarheidsinterval van de asafsnede liggen. Indien dit niet het geval is, zal er sprake zijn van een absolute systematische fout. De gevonden kalibratielijn gaat niet door de oorsprong. Bij spectrometrie staat de richtingscoëfficiënt gelijk aan de molaire extinctiecoëfficiënt. Indien de berekende betrouwbaarheidsinterval niet binnen de literatuurwaarde (extinctiecoëfficiënt) ligt, is er sprake van een relatieve systematische fout. [64]

Correlatiecoëfficiënt

Voor een rechte lijn wordt de correlatiecoëfficiënt (R) berekent. Het is een maat voor de samenhang tussen de X en Y waarde. Deze waarde kan variëren tussen de -1 en +1. De correlatie is het sterkst, indien de gevonden het dichtst bij de 1 is. De correlatiecoëfficiënt is één van de meest gebruikte analytische parameter. Echter wordt deze waarde vaak verkeerd geïnterpreteerd. Het is bijvoorbeeld geen maat voor de lineariteit, maar een meting op de correlatie. De R kan berekent worden met de formule: Sxy/(√Sxx*Syy). Voor een goede kalibratielijn wordt de minimale eis op R= 0.995 gesteld. Indien er onzuiverheden op een laag niveau worden geanalyseerd, zal de minimale eis op R= 0.980 worden gespecificeerd. [64][66]

3.2.2 Goodness of fit test

Zoals eerder werd besproken kan er door middel van een GOF bepaald worden of de variatie tussen de spreidingen van de meetwaarden correct is. Om dit te bewerkstelligen, zal er ook nu gebruik gemaakt worden van de kwadratensommen. Tevens zijn er enkele gegevens van het zwaartepunt (middelpunt) uit de kalibratielijn nodig. Dit werd bewerkstelligd door de kerngrootheden SSres (vergelijking 10) en SSfact (vergelijking 11) te bepalen. Vaak is het gewenst dat de spreiding tussen de geschatte waarde en zwaartepunt (SSfac) hoog is. In tegenstelling hiervan, dient het verschil tussen de respons en geschatte waarde (SSres) klein te zijn. Met deze twee kerngrootheden kan de GOF-waarde met vergelijking 12 worden bepaald.

SSRes= � (Ygemeten − Ygeschat)n 2

i=1 (10)

SSFact= � (Ygeschat − Ygemiddelde)n 2

i=1 (11)

Fgof =SSFact/(p−1)_{SSRes/(n−p)} (12)

Waarbij:

SSres = Kwadratensom van de afwijking van de meetwaarde ten opzichte van de geschatte respons SSfact = Kwadratensom van de geschatte respons ten opzichte van het zwaartepunt

De berekende GOF waarde wordt vervolgens vergeleken met de waarde uit een F-tabel (p-1, n-p). Wanneer de berekende F-waarde groter is dan de tabelwaarde, dan wordt het model significant goed verklaard. [64]

3.2.3 Lack of fit test

Deze test wordt uitgevoerd om vast te stellen of het model wel of niet bij de verkregen data past. Het kan alleen uitgevoerd worden wanneer een standaard minstens in 2-voud is geanalyseerd. De gemeten standaarden (Yi) worden vergeleken met het groepsgemiddelde (Ygemiddelde), waarna de afwijkingen weer als kwadratensommen worden weergegeven. Indien de data bij het model passen, zullen de groepsgemiddelde dicht bij de lijn liggen van Ygeschat. De variaties van beiden worden met elkaar vergeleken met een statistische F-toets (vergelijking 13). [64]

LOF =SSlof÷(f−p)_{SSpe÷(n−f)} (13) Waarbij:

SSlof = Kwadratensom van Ygemiddelde ten opzichte van Ygeschat SSpe = Kwadratensom van Ygemeten (i=1) ten opzichte van Ygemiddelde f = Aantal standaarden met verschillende waarde concentratie p = Aantal parameters

De berekende LOF-waarde dient kleiner te zijn dan de corresponderende F-tabelwaarde (f-p, n-f). Indien dat niet het geval is, verklaart het model de variatie in de metingen significant. Dit resulteert in een lack of fit tussen het model en de data. Een nieuwe model zal aan de orde moeten komen. [64]

3.3 D

De detectiegrens kan worden onderscheiden in twee verschillende types; limit of detection en de limit of quantitation. Het verschil tussen beide validatiepunten zal kort worden besproken.

De LOD is het minimale meetsignaal dat waargenomen kan worden van de te bepalen component. De detectiegrens wordt bepaald door de signaal/ruis (S/N) verhouding. Het signaal van de te bepalen component moet minimaal drie maal het signaal van de ruis zijn. Een lagere waarde is niet meer te onderscheiden van de blanco. Meetoplossingen met een bekende lage concentratie analyt worden vergeleken met blanco meetoplossingen, waarna de LOD wordt bevestigd. De LOQ van een individuele component is de laagste concentratie analyt, welke met een redelijke accuracy en precisie bepaald kan worden. Het signaal van de te bepalen component moet ten minste tien maal het signaal van de ruis zijn. Evenals de LOD worden meetoplossingen met een bekende concentratie analyt met blanco meetoplossingen vergeleken. De berekening is op basis van een S/N van 10. De LOD en LOQ wordt geïllustreerd in figuur 20 en bepaald met vergelijking 14 en 15. [50][65]

LOD =3∗C∗Ruis B_{Ruis A} (14)

LOQ =10∗C∗Ruis B_{Ruis A} (15) Waarbij:

LOD = Limit of Detection (mg/L) LOQ = Limit of Quantitation (mg/L) C = Concentratie analyt (mg/L) RuisA = Hoogte ruis analyt (mAU) Ruis B = Hoogte ruis blanco (mAU) Figuur 20: Piek A = LOD (3xruis) en piek B = LOQ (10xruis) [67]

3.4 P

De precisie beoordeelt de kwaliteit van de onderlinge spreiding tussen de meetresultaten. Men kan dit onderverdelen in herhaalbaarheid en intermediaire precisie. De precisie wordt uitgevoerd op het testmonsters, en niet op de standaarden. De accuracy (gebaseerd op de recovery) van een methode geeft aan of dat het resultaat voor een te bepalen component binnen vooraf gestelde grenzen overeenkomt met de werkelijke waarde. [50][54][65][68]

3.4.1 Herhaalbaarheid

De herhaalbaarheid is een mate van spreiding tussen de verkregen resultaten. Deze zijn precies onder dezelfde omstandigheden gemeten en tien maal herhaald. Eisen voor dezelfde omstandigheden zijn:

• Hetzelfde monstermateriaal • Binnen kort tijdsbestek gemeten • Dezelfde analist

• Dezelfde instrumenten en parameters • Dezelfde chemicaliën en standaarden

Deze bepaling wordt op een enkele ijklijn uitgevoerd. De gemiddelde concentratie en de retentie verschuivingen zullen bepaald worden. Vervolgens wordt de relatieve standaarddeviatie berekend volgens vergelijking 16:

𝑅𝑆𝐷% =_XgemmiddeldeSr x 100% (16)

Waarbij:

RSD% = Relatieve standaard deviatie in procenten Sr = Standaarddeviatie herhaalbaarheid Xgemiddelde = Gemiddelde concentratie (mg/L)

3.4.2 Intermediaire precisie

De intermediaire precisie geeft een indicatie over de nauwkeurigheid tussen de gemiddelde metingen, welke onder andere omstandigheden zijn verricht. De methode is reproduceerbaar wanneer er onder andere omstandigheden gelijkwaardige resultaten kan worden verkregen. Onder andere omstandigheden wordt bedoeld:

• Zelfde monster maar andere analist • Andere tijdstip

• Andere apparaat of hulpmiddel • Andere aanmaak van kalibratielijn • Chemicaliën van een andere batch

De analyses op de monsters word door een secundaire analist op een andere dag in tienvoud geanalyseerd. De gemiddelde resultaten van de gevonden concentratie en retentietijd verschuivingen worden vergeleken met de resultaten van de herhaalbaarheid.[50][54][69][70]

3.4.3 Recovery

De accuracy wordt bepaald aan de hand van de recovery. Met deze term wordt bedoeld welk percentage van een component er wordt teruggevonden bij een analyse ten opzichte van een bekende concentratie analyt in het monster. Gecertificeerde monsters zullen gebruikt worden als de nominale concentratie. Tevens is het mogelijk om in een blanco matrix een bekende concentratie analyt te “spiken” indien de referenties niet aanwezig zijn. De recovery wordt samen met de bijbehorende betrouwbaarheidsinterval (95%) in vergelijking 17 en 18 weergegeven. [71]

Recovery =Bepaalde concentratie analyt _{Nominale concentratie analyt}× 100% (17)

Recovery (BI95%) = ±t ∗Stdev_√N (18)

Waarbij:

t = Statistisch getal uit t-tabel (N-1)

Stdev = Standaarddeviatie recovery op basis van N-waarnemingen Bepaalde concentratie = Bepaalde concentratie uit de ijklijn (mg/L)

Nominale concentratie = Bekende concentratie analyt in monster(mg/L)

N = Aantal waarnemingen

In deze studie wordt de accuracy (op basis van de recovery) op 3 verschillende concentratie niveaus (80, 100 en 120%) van ACE in L13082904 en L13082906 bepaald. De analyse bij een concentratieniveau van 100% wordt onder andere omstandigheden (analist, chemicaliën, etc.) uitgevoerd om de precisie te bepalen. Indien de gestelde criteria zijn overschreden, vereist de methode verbetering. [50][54][65][68]

3.5 S

De stabiliteit is een belangrijk validatiepunt, welke een oordeel kan geven over de ontwikkelde methode gerelateerd aan de tijd. Componenten kunnen in verloop van tijd degraderen, waardoor de kwaliteit van de meetoplossingen kan afnemen. Alhoewel ACE als stabiel wordt verklaard, is het nog niet geëxperimenteerd in opgeloste vorm met de bijbehorende matrixverhoudingen. De stabiliteit op lange termijn van het product wordt tijdens dit project wel uitgevoerd, maar niet verder besproken. Dit in verband met de tijdsduur (36 maanden). Het product wordt hiermee getest onder verschillende bewaaromstandigheden zoals variërende temperaturen, luchtvochtigheid en verpakkingen. Drie typen stabiliteit op korte termijn met betrekking tot de meetoplossingen komen wel aan de orde tijdens de methode ontwikkeling; het meetsysteem, de meetoplossingen en de mobiele fase. [65]

3.5.1 Stabiliteit meetsysteem

De stabiliteit van het systeem kan bepaald worden door op dezelfde dag viermaal de analyse uit te voeren. Dit moet gebeuren in een tijdsbestek van 6 uur, waarbij de meetoplossingen op 4 intervallen worden geanalyseerd. Het absolute verschil tussen T0 en T6 wordt in percentages uitgedrukt. [65]

3.5.2 Stabiliteit meetoplossingen

De stabiliteit van de meetoplossingen worden gedurende vier dagen bepaald. Dagelijks zullen alle meetoplossingen geanalyseerd worden. Het absolute verschil tussen de gemiddelden van dag 1 ten opzichte van andere dagen wordt procentueel bepaald. [65]

3.5.3 Stabiliteit mobiele fase

De stabiliteit van de mobiele fase wordt bepaald door vast te stellen wat de mate van retentieverschuivingen is van de componenten op verschillende tijdstippen. De mobiele fase wordt net als de stabiliteit van de meetoplossingen op verschillende intervallen gemeten gedurende 4 dagen. Procentuele verschuivingen worden uitgedrukt in RSD%. [65]

Zowel het meetsysteem en de retentietijden van de mobiele fase mogen niet meer dan 5% afwijken ten opzichte van de initiële waarde (T0). [65]

3.6 S

Een stress onderzoek heeft als doel om potentiële degradatieproducten van ACE te creëren onder verschillende omstandigheden. Geforceerde degradatieproducten kunnen geïdentificeerd worden om de ontwikkelde methode te ondersteunen. Tevens kan het onderzoek een aanvulling zijn op de keuze van verpakking van het product. Verschillende objectieven van de analyse van geforceerde degradatie oplossingen zullen aan de orde komen:

1. Het aantonen van de afbraak op de actieve component 2. Het aantonen dat piek kwantificatie niet wordt verstoord

3. Het aantonen van de potentie om afbraakproducten te detecteren 4. Het aantonen van de massabalans.

De condities waarmee het product wordt gestrest worden samen met de bijbehorende procedure in tabel 4 weergegeven. Verschillende degradatiestudies op ACE zijn eerder in 1997 en 2000 uitgevoerd, waarbij informatie over degradatieproducten werd verkregen. Resultaten uit deze studies zullen eveneens in tabel 4 vermeld staan. [2][50][72][73][74][75]