Ontwikkeling en validatie van een Dried Blood Spot methode voor de analyse van de immunosuppressiva Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus met UPLC-MS/MS

Afstudeerverslag

Ontwikkeling en validatie van een

Dried Blood Spot methode voor de analyse van de

immunosuppressiva Ciclosporine, Tacrolimus,

Sirolimus en Everolimus met UPLC-MS/MS

2

Afstudeerverslag

Ontwikkeling en validatie van een Dried Blood Spot methode voor de analyse van de immunosuppressiva

Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus met UPLC-MS/MS

Student: Jacolien Mijs

j.mijs@student.avans.nl

Opleiding: Chemie, major Forensisch Laboratorium Onderzoek

Afstudeerinstelling: Erasmus MC, Apotheeklaboratorium Wytemaweg 80, Rotterdam

Mentor: Dr. B. C. P. Koch

b.koch@erasmusmc.nl

Begeleider: Ing. B.C.H. van der Nagel

b.vandernagel@erasmusmc.nl Onderwijsinstelling: Avans Hogeschool

Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Lovensdijkstraat 61-63, Breda

Docentbegeleider: Pablo Contreras Carballada p.contrerascarballada@avans.nl Afstudeerperiode: 20-01-2014 t/m 13-06-2014

3

Voorwoord

Dit afstudeerverslag vormt het resultaat van mijn stage- en afstudeerproject bij het apotheeklaboratorium van het Erasmus Medisch Centrum in Rotterdam.

In het apotheeklaboratorium van het Erasmus Medisch Centrum worden klinisch farmaceutische en toxicologische analyses uitgevoerd. Het gaat hierbij om het identificeren en kwantificeren van geneesmiddelen, verdovende middelen en andere exogene stoffen in biologisch patiëntmateriaal. Het doel van deze analyses is het optimaliseren van de toepassing van een geneesmiddel, het ondersteunen van de diagnose en behandeling van een intoxicatie en het dienen voor wetenschappelijk onderzoek. Mijn drijfveer om binnen het vakgebied van mijn opleiding een bijdrage te leveren binnen de gezondheidzorg en op deze manier van indirecte betekenis te zijn voor het welzijn van mijn medemens, wekte mijn belangstelling voor klinisch farmaceutische en toxicologische analyses. Dit bracht mij uiteindelijk bij het apotheeklaboratorium van het Erasmus Medisch Centrum.

Het onderzoek waarmee ik me heb bezig gehouden, bestond uit het ontwikkelen en valideren van een Dried Blood Spot methode voor de analyse van de immunosuppressivamiddelen Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus met Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Ik vond het een uitdaging om me te verdiepen in Dried Blood Spot als een voor de apotheek nieuwe onderzoeksmatrix. Ik ben blij dat ik mijn onderzoek heb kunnen voortzetten tot het (bijna) implementeren van de eerste Dried Blood Spot methode in het apotheeklaboratorium.

Hierbij wil ik graag dr. Birgit Koch bedanken voor de mogelijkheid om mijn stage- en afstudeerproject bij de apotheek van het Erasmus Medisch Centrum uit te voeren. Ook wil ik Ing. Bart van der Nagel bedanken voor de begeleiding tijdens mijn onderzoek, zijn bereidheid om mee te denken en zijn waardevolle ideeën en tips die me steeds verder hebben geholpen. Zonder iemand te kort te doen, wil ik iedereen van de afdeling apotheek bedanken voor hun hulp, medewerking en de gezellige tijd. Ten slotte wil ik Pablo Contreras Carballada en Liesbeth van Mourik bedanken voor de goede begeleiding vanuit Avans Hogeschool.

Jacolien Mijs,

4

Samenvatting

Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus zijn geneesmiddelen die worden toegepast als immunosuppressiva. Ze worden voorgeschreven ter voorkoming van afstoting van transplantaten. Door middel van Therapeutic Drug Monitoring wordt geprobeerd zowel onder- als overdosering te voorkomen.

Tot nu toe was het in het apotheeklaboratorium van het Erasmus Medisch Centrum alleen mogelijk om de vier genoemde immunosuppressiva kwantitatief te bepalen in veneus afgenomen bloedsamples, hierna volbloedmethode voor immunosuppressiva zonder DBS genoemd. Na een korte monstervoorbewerking en een chromatografische scheiding met behulp van Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) tussen analyten, interne standaarden en storende componenten van de biologische matrix werden de analyten gekwantificeerd door middel van Tandem Mass Spectrometry (MS/MS).

Een interessant alternatief voor klassieke veneuze bloedsamples is de Dried Blood Spot methode. Dit is een patiëntvriendelijke methode waarbij slechts enkele bloeddruppels nodig zijn die op speciaal daarvoor bestemde kaarten worden gedruppeld. Dit kan door de patiënt thuis worden uitgevoerd zonder een medisch laboratorium te hoeven bezoeken. Vanuit de kliniek werd er gevraagd of er een dergelijke methode kon worden ontwikkeld.

Bij de ontwikkeling van de methode lag de nadruk op de monstervoorbewerking. Hierbij werden er diverse combinaties van de te variëren parameters onderzocht, zoals het type DBS-kaart, de doorsnede van de punch, het type en volume extractieoplossing en het type standaarden en QC’s.

Uit het onderzoek naar het meest geschikte type DBS-kaarten kan er aan de hand van de piekoppervlakten worden geconcludeerd dat er beter DBS-kaarten van Whatman dan van Agilent kunnen worden gebruikt om er bloed op te laten druppelen. Hierbij is er rekening gehouden dat de bloodspots op DBS-kaarten van Whatman groter zijn dan de bloodspots op kaarten van Agilent.

Er is onderzocht of er beter methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 of methanol/MilliQ-water 80:20 als extractieoplossing kan worden toegevoegd. De piekoppervlakten voor methanol/MilliQ-water 80:20 waren niet consequent hoger of lager dan de piekoppervlakten voor methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1. Doordat de methanol/zinksulfaatoplossing ook bij de volbloedmethode voor immunosuppressiva zonder DBS wordt gebruikt, is er gekozen om deze oplossing ook bij de DBS-methode toe te passen. Als interne standaard worden er isotoop-gelabelde vormen van de analyten gebruikt welke aanwezig zijn in de methanol/zinksulfaatoplossing.

Uit onderzoek is gebleken dat er uit een bloodspot het beste een punch met een grote oppervlakte kan worden genomen doordat deze meer analyt kan bevatten en de piekoppervlakten als gevolg daarvan hoger zijn. Een punch met een doorsnede van 6 mm heeft daarom de voorkeur boven een punch met een doorsnede van 3 mm.

5

Er is onderzocht of er beter 100 µL of 200 µL extractieoplossing kan worden toegevoegd. Bij een kleiner volume extractieoplossing wordt het bloedsample minder verdund waardoor de piekoppervlakten hoger zijn. Op basis hiervan is er gekozen om te werken met 100 µL extractieoplossing.

Wanneer deze parameters omtrent monstervoorbewerking bij patiëntsamples werd toegepast bij gebruik van ingekochte standaarden voor de calibratielijn, waren de medicijnconcentraties van deze samples ongeveer 40% hoger dan met de volbloedmethode zonder DBS was bepaald. Er werd gedacht dat het verschil tussen het soort bloed van de patiëntsamples (vers, niet gelyseerd) en de ingekochte standaarden (gelyseerd) hier een verklaring van zou kunnen zijn. Zodoende zijn er zelf standaarden en QC’s gemaakt door vers volbloed te spiken. De QC’s die gemaakt zijn, hadden verschillende hematocrietwaarden. Om te testen of de standaarden en QC’s goed gemaakt waren, zijn ze eerst opgewerkt zonder het gebruik van DBS-kaarten, volgens de volbloedmethode voor immunosuppressiva zonder DBS. De concentraties van de zelfgemaakte standaarden en QC’s vertoonden geen opvallend grote afwijkingen of duploverschillen waarna ze opgewerkt zijn volgens de DBS-monstervoorbewerking. Hierbij vertoonden de concentraties van zowel de standaarden als de QC’s met verschillende hematocrietwaarden regelmatig afwijkingen groter dan de vastgelegde 15% en duploverschillen groter dan 10%. Er werd verondersteld dat de extractie-efficiëntie diende te worden vergroot. Dit werd geprobeerd door de zelfgemaakte standaarden en QC’s na het vortexen 15 minuten bij 60 °C te ultrasoneren. Het ultrasoneren van de samples vergrootte de piekoppervlakten met ongeveer 35%. Er is onderzocht dat een langere tijd ultrasoneren geen invloed heeft op de piekoppervlakten. De medicijnconcentraties van de patiëntsamples waren echter nog steeds 20% hoger dan met de volbloedmethode zonder DBS was bepaald. Er werd gedacht dat 100 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 niet voldoende zou zijn om het analyt van de bloodspot te extraheren. Om deze reden is er teruggegaan naar het toevoegen van 200 µL methanol/zinksulfaatoplossing in plaats van 100 µL. De combinatie van 15 minuten bij 60 °C ultrasoneren en het gebruik van 200 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 leidde tot medicijnconcentraties van patiëntsamples die minder dan de vastgelegde 15% afwijking vertoonden ten opzichte van de volbloedmethode zonder DBS. Echter waren de afwijkingen van de standaarden en QC’s nog regelmatig groter dan 15% en de duploverschillen groter dan 10% waardoor de calibratielijn niet aan de eisen van lineariteit voldeed. Er is toen teruggegaan naar het gebruik van ingekochte standaarden en QC’s en het hierbij toepassen van een correctiefactor. Uit het onderzoek naar het gebruik van een Ostro-plaat om fosfolipiden te verminderen kan worden opgemaakt dat een dergelijke plaat tot een schoner extract leidt. Het heeft echter geen invloed op de medicijnconcentraties van de patiëntsamples.

Bij de uiteindelijke monstervoorbewerking werd er 50 µL bloed op de aangegeven plaats op een DBS-kaart van Whatman aangebracht. Deze werd 2 uur bij kamertemperatuur gedroogd. Vervolgens werd er uit elke bloodspot een punch genomen met een doorsnede van 6 mm. Hieraan werd 200 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 toegevoegd om het daarna enkele seconden te vortexen en 15 minuten bij 60 °C te ultrasoneren. Het supernatant werd overgebracht in afzonderlijke vials met insert. Hierbij werd gebruik gemaakt van ingekochte standaarden en QC’s van respectievelijk Chromsystems en Recipe.

6

Nadat er een geschikte monstervoorbewerking verkregen was, is de methode gevalideerd. Er is aandacht besteed aan de lineariteit, herhaalbaarheid, juistheid, robuustheid, in-proces-stabiliteit en schaduwdraaien. Uit de resultaten kan de conclusie worden getrokken dat de lineariteit, herhaalbaarheid en robuustheid aan de eisen voldoen. Bij lineariteit valt het verschil tussen de theoretische concentratie en de gemeten concentratie voor elke standaard afzonderlijk binnen de eis van 15%. De meetpunten zijn random verdeeld rond een afwijking van 0%. R is groter dan 0,995 en R2 is groter dan 0,990. Bij de herhaalbaarheid valt de relatieve standaarddeviatie voor elk concentratieniveau van de QC’s binnen de eis van 15%. Bij het onderzoek van de robuustheid is er bepaald dat de invloed van het volume bloed op een DBS-kaart binnen de eis van 15% valt. Bij juistheid valt het verschil tussen de theoretische concentratie en het gemiddelde van de gemeten concentraties voor elk concentratieniveau van de QC’s binnen de eis van 15% bij Ciclosporine, Tacrolimus en Sirolimus. Bij Everolimus is dit verschil voor QC 2 en QC 3 groter dan 15% waarmee het niet aan de eisen van juistheid voldoet. Uit het onderzoek van de in-proces-stabiliteit is gebleken dat voor alle vier immunosuppressiva na 24 uur bij zowel kamertemperatuur als 40 °C er meerdere QC’s een recovery vertonen die niet binnen de eis van 90 - 110% valt. Dit betekent dat de resultaten van analyses met DBS-kaarten die niet binnen enkele uren worden geanalyseerd niet betrouwbaar zijn. Dit neemt één van de grootste voordelen van een DBS-methode weg. Er wordt aangeraden om het onderzoek van de in-proces-stabiliteit opnieuw uit te voeren met het gebruik van patiëntsamples in plaats van QC’s om de werkelijke situatie zo goed mogelijk na te bootsen. Bij het schaduwdraaien van patiëntsamples waarbij de volbloedmethode zonder DBS als referentiemethode werd gebruikt, vertoonden bij Ciclosporine alle patiëntsamples (n = 24) een recovery tussen 78% en 123% waarvan eenentwintig patiëntsamples tussen 85% en 115%. Hierbij waren de patiëntsamples bij Ciclosporine redelijk regelmatig verdeeld rond een recovery van 100%. Het was opvallend dat bij Tacrolimus tien van de tweeëntwintig patiëntsamples een recovery tussen 85% en 115% vertoonden, tien patiëntsamples vertoonden een recovery hoger dan 115% en twee patiëntsamples vertoonden een recovery lager dan 85%. Als gevolg hiervan dient er opnieuw aandacht te worden besteed aan het bepalen van de juiste correctiefactor. Bij Sirolimus vertoonden alle vier de gemeten patiëntsamples een recovery hoger dan 100% waarvan twee hoger dan 115%. Bij Everolimus vertoonden twee van de drie patiëntsamples een recovery tussen 85% en 115% en het andere patiëntsample vertoonde een recovery lager dan 85%. Vanwege het kleine aantal patiëntsamples dat bij Sirolimus en Everolimus voor schaduwdraaien is gebruikt, is het lastig om te beslissen of er de juiste correctiefactor is toegepast. Recoveries lager dan 85% en hoger dan 115% zouden veroorzaakt kunnen worden door een afwijkend hematocriet van de patiëntsamples.

Na verder onderzoek van de juiste correctiefactor, de invloed van het hematocriet en de in-proces-stabiliteit kan de DBS-methode voor immunosuppressiva geïmplementeerd worden voor routinematig gebruik.

7

Summary

Ciclosporin, Tacrolimus, Sirolimus and Everolimus are drugs that are used as immunosuppressants. They are prescribed for the prevention of transplant rejection. Therapeutic Drug Monitoring is used to avoid both under-and overdosage.

Until now, in the pharmacy laboratory of the Erasmus Medical Centre it was only possible to determine quantitatively the venous blood samples in the four mentioned immunosuppressants. After a short sample preparation and chromatographic separation with the aid of an Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) between analytes, internal standards, and interfering components of the biological matrix, the analytes were quantified by means of Tandem Mass Spectrometry (MS / MS). An interesting alternative to classic venous blood samples is the Dried Blood Spot method. This is a patient-friendly method in which only a few drops of blood are needed that will be blotted on dedicated cards. This can be performed by the patient at home without having to visit a medical laboratory. The clinic asked whether such a method could be developed.

In developing the method the focus was on the sample preparation. Various combinations of the various parameters were studied such as the type of DBS-card, the cross section of the punch, the type and volume of the extraction solution, and the type of standards and QC’s.

After the investigation of the most suitable type DBS-cards, it can be concluded based on peak areas that DBS-cards of Whatman are better than Agilent to drip blood on.

It was taken into account that the blood spots on Whatman DBS cards are larger than the blood spots on cards from Agilent.

It has been studied whether it is better if methanol/0,1 M zinc sulfate solution 2:1 or methanol/MilliQ-water 80:20 as extraction solution is added. The peak areas of methanol/MilliQ-methanol/MilliQ-water 80:20 were not consistently higher or lower than the peak areas of methanol/0,1 M zinc sulfate solution 2:1. Because the methanol/zinc sulfate solution is used in the whole blood method for immunosuppressant without DBS, it was chosen to apply this solution with the DBS method. As internal standard isotope-labeled forms of the analytes were used which are present in the methanol/zinc sulfate solution.

Research has shown that from a blood spot it is best to use a punch with a large surface area because this can contain more analyte and the peak areas are higher as a result. A punch with a diameter of 6 mm is therefore preferable to a punch with a diameter of 3 mm.

It was examined whether it is better if 100 µL or 200 µL extraction solution is added. At a smaller volume is less diluted blood sample extraction solution whereby the peak surfaces are higher. At a smaller volume extraction solution the blood sample is less diluted so that the peak areas are higher. Based on this, the decision was made to work with 100 µL extraction solution.

8

When these factors of sample pre-treatment in the patient samples was applied with the use of standards purchased for the calibration line, the drug concentrations of these samples were about 40% higher than when determined with the whole blood method without DBS. It was thought that the difference between the blood type of the patient samples (fresh, not lysed) and purchased standards (lysed) could be an explanation of this. Thus standards and QC’s were made by spiking fresh whole blood. The newly made QC's had different hematocrit values. To test whether the standards and QC’s were made correctly, they were first processed without the use of DBS-cards, according to the whole blood method for immunosuppressivants. The concentration of the homemade standards and QC’s did not show remarkably large deviations of duplicate differences after which they worked according to the DBS sample preparation. It regularly showed the concentrations of both the standards and the QC’s which had different hematocrit values, deviated larger than the defined 15% and duplicate differences greater than 10%. It was assumed that the extraction efficiency should be increased. This was attempted by the self-made standards and QC's after vortexing, for 15 minutes at 60 °C to ultrasone. Ultrasoning of the samples increased the peak areas with about 35%. It has been researched that ultrasoned for a longer period has no influence on the peak areas. However the drug concentrations in the patient samples were still 20% higher than when determined with using the whole blood method. It was thought that 100 µL methanol/0,1 M zinc sulfate solution 2:1 would not be sufficient to extract the analyte of the blood spot. For this reason it was decided to add 200 µL methanol/zinc sulfate solution instead of 100 µL. The combination of ultrasoning for 15 minutes at 60 °C and the use of 200 µL methanol/0,1 M zinc sulfate solution 2:1 resulted in drug concentrations of patient samples that showed less than the defined deviation of 15% compared to the whole blood method. However the deviations from the standards and QC’s were still regularly greater than 15% and the duplicate differences were greater than 10%, therefore the calibration line does not meet the requirements of linearity. It was then decided to return to the use of purchased standards and QC’s and hereby applying a correction factor. The research into the use of an Ostro plate to reduce phospholipids shows that such a plate leads to a cleaner extract. However it has no effect on the drug concentration of the patient samples.

In the final sample pretreatment 50 µL blood sample was blotted in the marked place on a DBS-card of Whatman. This was dried at room temperature for 2 hours. Then from each blood spot a punch was taken with a diameter of 6 mm. To this 200 µL methanol/0,1 M zinc sulfate solution 2:1 was added, after which was vortexed for a few seconds and ultrasonering for 15 minutes at 60 °C. The supernatant was transferred into separate vials with insert. Herewith purchased standards and QC’s of respectively Chromsystems and Recipe were used.

When there was an appropriate sample for processing, the method was validated. Attention was paid to the linearity, repeatability, accuracy, robustness, in-process stability and shadowing. From the results of the validation, the conclusion can be drawn that the linearity, repeatability and robustness meet the requirements. By linearity, the difference between the theoretical concentration and the measured concentration of each standard is separately within the requirement of 15%. The data points are distributed around residual = 0%. R is greater than 0,995 and R2 is greater than 0,990. The repeatability of the relative standard deviation for each concentration level of the QC’s was within the requirement of 15%.

9

In the examination of the robustness it has been determined that the influence of the volume of blood on a DSB-card is within the requirement of 15%. Regarding correctness the difference between the theoretical concentration and the mean of the concentrations measured for each concentration level of the QC’s falls within the required 15% for Ciclosporin, Tacrolimus and Sirolimus. For Everolimus this difference for QC 2 and QC 3 is greater than 15%, which means it does not meet the requirements of accuracy. The investigation of the in-process stability has shown that for all four immunosuppressants after 24 hours at both room temperature and 40 °C there are multiple QC’s with a recovery which does not fall within the requirement of 90 - 110%. This means that the results of analyses with DBS cards that can not be analyzed within a few hours are not reliable. This eliminates one of the biggest advantages of a DBS-method. It is recommended to redo the study of the in-process stability with the use of patient samples instead of QC's to mimic the real situation as closely as possible. When the DBS-method for immunosuppressants was compared with the whole blood method for immunosuppressants without DBS, in Ciclosporin all patient samples (n = 24) showed a recovery between 78% and 123% of which twenty-one between 85% en 115%. The patient samples were reasonably evenly distributed in Ciclosporin around a recovery of 100%. It was striking Tacrolimus showed in ten of twenty-two patient samples a recovery between 85% and 115%, ten patient samples showed a recovery greater than 115% and two patient samples showed a recovery lower than 85%. As a result there should be renewed attention paid to the determination of the proper correction factor. In Sirolimus it showed that all four measured patient samples had a recovery higher than 100% of which two exceed 115%. In Everolimus two of the three patient samples showed a recovery between 85% and 115% and the other patient sample showed a recovery lower than 85%. Due to the small number of patient samples that is used to run the new Sirolimus and Everolimus analyses, it is difficult to decide whether the appropriate correction factor has been applied. Recoveries lower than 85% and greater than 115% may be caused by different hematocrit of the patient samples.

After further investigation of the proper correction factor, the influence of the hematocrit and the in-process stability, the DBS method can be implemented for immunosuppressants for routine use.

10

Inhoudsopgave

2.1 Therapeutic Drug Monitoring ... 15

2.2 Immunosuppressiva ... 15

2.2.1 Ciclosporine ... 16

2.2.2 Tacrolimus ... 16

2.2.3 Sirolimus ... 17

2.2.4 Everolimus ... 17

2.3 Dried Blood Spot methode ... 18

2.3.1 Uitvoering van Dried Blood Spot methode ... 18

2.3.2 Voordelen van Dried Blood Spot methode ... 18

2.3.3 Nadelen van Dried Blood Spot methode ... 19

2.4 Analysetechniek ... 19

2.4.1 Monstervoorbewerking ... 19

2.4.2 Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry ... 20

2.5 Validatie ... 21

2.5.1 Lineariteit ... 21

2.5.2 Limit of detection ... 21

2.5.3. Lower limit of quantification ... 22

2.5.4 Herhaalbaarheid ... 22 2.5.5 Juistheid ... 22 2.5.6 Reproduceerbaarheid ... 22 2.5.7 Robuustheid ... 22 2.5.8 Carry-over ... 22 2.5.9 Houdbaarheid ... 22 2.5.10 Schaduwdraaien ... 22

11 3 Materiaal en methoden ... 23 3.1 Chemicaliën ... 23 3.2 Instrumenten ... 23 3.3 Eluentia ... 23 3.3 Standaarden en controles ... 23 3.4 Extractieoplossing ... 25 3.5 Monstervoorbewerking ... 25 3.6 LC-MS/MS-instellingen ... 27 3.7 Validatie ... 27 3.7.1 Lineariteit ... 28 3.7.2 Limit of detection ... 28

3.7.3 Lower limit of quantification ... 28

3.7.4. Herhaalbaarheid ... 28 3.7.5. Juistheid ... 28 3.7.6 Reproduceerbaarheid ... 29 3.7.7. Robuustheid ... 29 3.7.8 Carry-over ... 29 3.7.9 Houdbaarheid ... 29 3.7.10 Schaduwdraaien ... 29 4 Resultaten ... 30 4.1 Monstervoorbewerking ... 30 4.1.1 Type DBS-kaarten ... 30 4.1.2 Type extractieoplossing ... 31 4.1.3 Doorsnede punch ... 32 4.1.4 Volume extractieoplossing ... 34 4.1.5 Standaarden en QC’s ... 35 4.2 Validatie ... 36 4.2.1 Lineariteit ... 37 4.2.2 Herhaalbaarheid ... 38 4.2.3 Juistheid ... 38 4.2.4 Robuustheid ... 39 4.2.5 Houdbaarheid ... 40

12 4.2.6 Schaduwdraaien ... 42 5 Discussie ... 45 6 Conclusie ... 50 7 Aanbevelingen ... 52 Literatuurlijst ... 53 Bijlagen ... 55 Overzicht bijlagen ... 55 Bijlage I: Pipetteerschema’s ... 56

Bijlage II: LC-MS/MS-instellingen ... 59

Bijlage III: Meetwaarden lineariteit ... 61

Bijlage IV: Meetwaarden herhaalbaarheid ... 65

Bijlage V: Meetwaarden juistheid ... 71

Bijlage VI: Meetwaarden robuustheid ... 77

Bijlage VII: Meetwaarden houdbaarheid ... 83

13

Afkortingenlijst

BEH Bridged Ethyl Hybrid

Conc Concentratie

Conc.theor. Theoretische concentratie Conc.gemeten Gemeten concentratie Conc.ref. Referentieconcentratie

CV Variatiecoëfficiënt

DBS Dried Blood Spot

ESI Electrospray Ionization

Gem Gemiddelde

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IS Interne standaard

ISE Ion-selectieve electrode

KT Kamertemperatuur

LLOQ Lower limit of quantitation

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantitation

MRM Multiple Reaction Monitoring

MS/MS Tandem Mass Spectrometry

mTOR Mammalian target of Rapamycin

QC Quality Control

RSD Relatieve standaarddeviatie

SD Standaarddeviatie

Std Standaard

TDM Therapeutic Drug Monitoring

ULOQ Upper limit of quantitation

UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography

14

1 Inleiding

Om afstoting van transplantaten te voorkomen, worden er immunosuppressiva voorgeschreven. Enkele voorbeelden van immunosuppressiva die vaak worden toegepast, zijn Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus. Door middel van regelmatige controles van de medicijnconcentratie wordt geprobeerd zowel onder- als overdosering te voorkomen.

Tot nu toe was het in het apotheeklaboratorium van het Erasmus Medisch Centrum alleen mogelijk om de vier genoemde immunosuppressiva kwantitatief te bepalen in veneus afgenomen bloedsamples. Na een korte monstervoorbewerking vond er chromatografische scheiding plaats met behulp van Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) en werden de analyten gekwantificeerd door middel van Tandem Mass Spectrometry (MS/MS).

Een interessant alternatief voor klassieke veneuze bloedsamples is de Dried Blood Spot methode (DBS-methode). Dit is een patiëntvriendelijke methode waarbij slechts enkele bloeddruppels nodig zijn die op speciaal daarvoor bestemde kaarten worden gedruppeld. Dit kan door de patiënt thuis worden uitgevoerd zonder een medisch laboratorium te hoeven bezoeken. Vanuit de kliniek werd er gevraagd of er een dergelijke methode kon worden ontwikkeld.

Het doel van het onderzoek was het ontwikkelen en valideren van een DBS-methode voor de analyse van Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus met UPLC-MS/MS. Bij de ontwikkeling van de methode lag de nadruk op de monstervoorbewerking. Hierbij werden er diverse combinaties van de te variëren parameters onderzocht, zoals het type DBS-kaart, de doorsnede van de punch, het type en volume extractieoplossing en het type standaarden en QC’s. Nadat er sprake was van een geschikte monstervoorbewerking, is de methode gevalideerd. Er is aandacht besteed aan de lineariteit, herhaalbaarheid, juistheid, robuustheid, houdbaarheid en schaduwdraaien.

In dit afstudeerverslag wordt eerst in hoofdstuk twee de theorie achter het onderzoek uitgelegd. Daarna worden in hoofdstuk drie de gebruikte materialen en methoden beschreven. Hoofdstuk vier bevat de resultaten van het verrichte onderzoek. Vervolgens worden in hoofdstuk vijf, zes en zeven respectievelijk de discussie, conclusie en aanbevelingen vermeld. Ten slotte zijn de literatuurlijst en de bijlagen weergegeven.

15

2 Theoretische achtergrond

Dit hoofdstuk beschrijft de theorie rondom de ontwikkelde Dried Blood Spot methode (DBS-methode) voor de analyse van Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus met Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS).

2.1 Therapeutic Drug Monitoring

Therapeutic Drug Monitoring (TDM) is een onderdeel van de klinische chemie en klinische farmacologie dat gespecialiseerd is in het handhaven van medicijnconcentraties in biologisch materiaal om patiënten een effectieve en veilige medicatietherapie aan te bieden. TDM is gebaseerd op de aanname dat er een definieerbare relatie is tussen dosis en medicijnconcentratie en tussen medicijnconcentratie en farmacodynamiek. Farmacodynamiek beschrijft de wijze waarop medicijnen op het lichaam werken. In verschillende onderzoeken is aangetoond dat een medicijnconcentratie een betere voorspeller is van klinische werkzaamheid dan dosis. [1] [2] [3] [4] [5]

TDM is een handige manier om therapeutische respons te verbeteren, therapietrouw te beoordelen en intoxicaties te vermijden. TDM wordt voornamelijk toegepast op medicijnen met een klein therapeutisch bereik. Hierbij is het verschil tussen subtherapeutische en toxische concentratie klein waardoor de geneesmiddelen gemakkelijk kunnen worden onder- of overgedoseerd. Bij de interpretatie van medicijnconcentraties dient er rekening te worden gehouden met het tijdstip van toediening, de dosis, de toedieningsweg- en vorm, het tijdstip van bloedafname, het soort bloedsample, de omstandigheden van opslag en gebruik van het medicijn, de nauwkeurigheid van de analysemethode, co-medicatie en de klinische toestand van de patiënt. [1] [2] [3] [4] [5]

Bloedsamples ten behoeve van TDM kunnen op twee verschillende tijdstippen worden genomen: gedurende de hoogste therapeutische concentratie van het medicijn (topspiegel, aan het begin van het doseringsinterval) of de laagste therapeutische concentratie (dalspiegel, aan het einde van het doseringsinterval). Topspiegels zijn bedoeld om de effectiviteit van een behandeling te garanderen, terwijl dalspiegels bedoeld zijn om toxiciteit te beperken. Over het algemeen worden er alleen dalspiegels bepaald. [1] [2] [3] [4] [5]

2.2 Immunosuppressiva

Immunosuppressiva zijn geneesmiddelen die de werking van het immuunsysteem remmen of voorkomen. Ze worden voorgeschreven bij aandoeningen waarbij de ontstekingsreactie van het lichaam ongewenst is, zoals bij auto-immuunziekten en bij weefsel- en orgaantransplantaties. Het doel van immunosuppressiva bij transplantaties is het onderdrukken van afstotingsreacties tegen het transplantaat of afweerreacties van het transplantaat tegen de ontvanger (graft-versus-hostreacties). Voorbeelden van immunosuppressiva die worden geïndiceerd ter voorkoming van afstoting van transplantaten zijn Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus. Omdat deze middelen een bestrijdende en geen genezende werking hebben, moeten ze na een transplantatie blijvend worden gebruikt. Vanwege de nogal ernstige bijwerkingen (nierbeschadiging en maagdarmklachten) van deze immunosuppressiva is TDM noodzakelijk. In tabel 1 wordt de therapeutische range en de toxische concentratie van de vier immunosuppressiva weergegeven. [6]

16

Tabel 1: Therapeutische range en toxische concentratie immunosuppressiva [7]

Component Therapeutische range (µg/L) Toxische concentratie (µg/L)

Ciclosporine 100 - 425 Gedurende meerdere dagen 400

Tacrolimus 4 - 15 Langdurig 20

Sirolimus 5 - 15 > 20

Everolimus 5 - 15 > 20

2.2.1 Ciclosporine

Ciclosporine is een lipofiele cyclische polypeptide van 11 aminozuren. De werking van Ciclosporine is gebaseerd op remming van calcineurine en daaropvolgende remming van ontwikkeling van T-lymfocyten en onderdrukking van T-cal receptor transcriptie van het interleukine-2 gen. Ciclosporine heeft als molecuulformule C62H111N11O12. De structuurformule is weergegeven in figuur 1. Ciclosporine wordt gemetaboliseerd in de lever door het cytochroom P450-enzymsysteem en in het maagdarmkanaal. De uitscheiding vindt voornamelijk plaats als metabolieten met de feces. [8] [9]

Figuur 1: Structuurformule Ciclosporine [10]

2.2.2 Tacrolimus

Tacrolimus is een cyclische lacton-ring met twee suikerringen (macrolide). Net als Ciclosporine remt Tacrolimus de signaaloverdracht van T-lymfocyten en vermindert het T-cel receptor transcriptie door remming van calcineurine. Tacrolimus heeft als molecuulformule C44H69NO12. De structuurformule is weergegeven in figuur 2. Tacrolimus wordt gemetaboliseerd in de lever door het cytochroom P450-enzymsysteem en in het maagdarmkanaal. De uitscheiding vindt voornamelijk plaats als metabolieten met de feces. [11] [12]

17

Figuur 2: Structuurformule Tacrolimus [10]

2.2.3 Sirolimus

Sirolimus, ook bekend onder de naam Rapamycin, is net als Tacrolimus een macrolide. De werking van Sirolimus is gebaseerd op remming van het eiwit mTOR (mammalian target of Rapamycin) dat het verloop van de celcyclus reguleert. Daarop volgt onderdrukking van de reactie van het interleukine-2 gen en blokkering van de activering van T- en B-cellen. Sirolimus heeft als molecuulformule C51H79NO13. De structuurformule is weergegeven in figuur 3. Sirolimus wordt gemetaboliseerd in de lever door het cytochroom P450-enzymsysteem en in het maagdarmkanaal. De uitscheiding van Sirolimus vindt voornamelijk plaats als metabolieten met de feces. [13] [14]

Figuur 3: Structuurformule Sirolimus [10]

2.2.4 Everolimus

Everolimus is een derivaat van Sirolimus. De werking van beide medicijnen is vergelijkbaar. Het onderdrukt de reactie van het interleukine-2 gen en blokkeert de activering van T- en B-cellen door remming van het eiwit mTOR. Everolimus heeft als molecuulformule C53H83NO14. De structuurformule is weergegeven in figuur 4. Everolimus wordt gemetaboliseerd in de lever door het cytochroom P450-enzymsysteem en in het maagdarmkanaal. De uitscheiding van Everolimus vindt voornamelijk plaats als metabolieten met de feces. [15]

18

Figuur 4: Structuurformule Everolimus [10]

2.3 Dried Blood Spot methode

De Dried Blood Spot methode (DBS-methode) wordt al meer dan 40 jaar in de klinische chemie gebruikt, meestal voor neonatale screening. Sindsdien worden veel klinische analyten, zoals nucleïnezuren, vetten en kleine moleculen met succes met de DBS-methode gemeten. Ook bij immunosuppressiva vormt de DBS-methode een interessant alternatief voor klassieke veneuze bloedsamples. [16] [17] [18] [19]

2.3.1 Uitvoering van Dried Blood Spot methode

Bij de DBS-methode moet het gebied (vinger of hiel) waar het vloed verzameld gaat worden eerst worden gedesinfecteerd. Daarna wordt de huid aangeprikt met een steriele lancet. De eerste bloeddruppel wordt weggeveegd en de daarop volgende druppels worden op de aangegeven plaats van het speciaal daarvoor bestemde papier gedruppeld. Nadat alle vereiste cirkels gevuld zijn, moet het papier drogen. Het drogen is erg belangrijk aangezien vocht bacteriële groei en schimmels bevordert en dit de extractie beïnvloed. Na het drogen wordt de DBS-kaart naar een laboratorium gestuurd. In het laboratorium wordt er een schijfje (“punch”) uit de bloedvlek (“bloodspot”) geponst en opgewerkt en geanalyseerd volgens een procedure specifiek voor het te bepalen analyt. In één bloodspot kunnen meerdere analyten worden geanalyseerd. [16] [17] [18] [19]

2.3.2 Voordelen van Dried Blood Spot methode

In vergelijking met conventionele bloedsamples biedt de DBS-methode praktische, klinische en financiële voordelen. Allereerst is de bloedafname voor de DBS-methode eenvoudig uit te voeren en relatief pijnloos. Dit kan door de patiënt thuis worden uitgevoerd zonder medische laboratoria te bezoeken. Deze bloedafname is veel minder ingrijpend dan venapunctie en is daarom meer geschikt voor patiënten die verschillende bloedonderzoeken moeten ondergaan en patiënten waarbij veneuze bloedafname lastig is zoals bij ouderen, kinderen en mindervaliden. Het gebruik van de DBS-methode minimaliseert ook de hoeveelheid bloed die moet worden afgenomen. Verder vermindert het drogen van de bloedvlek mogelijk besmettingsgevaar voor medisch personeel. Bovendien kunnen de kaarten per gewone post worden verzonden, zonder bijzonder gevaar voor besmetting. De DBS-methode is daarnaast een waardevolle aanwinst voor bloedafname in afgelegen dorpen die zich ver van een bloedafnamelocatie bevinden. Door het kleine formaat van de DBS-kaarten biedt de DBS-methode ook uitkomst bij het verminderen en vergemakkelijken van opslag in klinische laboratoria en biobanken.

19

Hierbij is het wel belangrijk dat de mogelijkheid van kruisbesmetting tussen kaarten wordt voorkomen. De eigenschappen van de DBS-methode bieden ook een uitgelezen kans voor pre-klinisch onderzoek, omdat er minder proefdieren nodig zijn. Vanuit medisch-economisch oogpunt is het interessant om op te merken dat het gebruik van de DBS-methode een aanzienlijke vermindering in de kosten geeft als gevolg van verminderde eisen aan opgeleid personeel en vergemakkelijking in transport, opslag en verwerking. [16] [17] [18] [19]

2.3.3 Nadelen van Dried Blood Spot methode

Een belangrijk nadeel van de DBS-methode bevindt zich in de aard van het biologisch monster. Bij een standaard bloedafname wordt serum of plasma geanalyseerd, terwijl DBS-samples op de daarvoor bestemde kaarten samengesteld zijn uit gehemolyseerd volbloed. Daardoor kunnen er interferenties ontstaan vanwege hemoglobine en kan de intracellulaire inhoud vrijkomen. De bloedcellen worden veranderd tijdens het droogproces waardoor cellulaire hematologische testen onmogelijk zijn. Het drogen van de DBS-kaarten kan ook eiwitten denatureren en de enzymatische activiteit van bloedeiwitten veranderen. Eventuele resterende cellen in de monsters kunnen ook de totale eiwitsamenstelling veranderen en daardoor de concentratie van een aantal analyten wijzigen. In bepaalde gevallen moeten bepaalde klinische ranges die voor standaard bloedsamples zijn ingesteld, worden aangepast. Er moet ook rekening worden gehouden met de hematocriet van het bloed dat de verspreiding van het bloed over het papier van DBS-kaarten beïnvloed. Met hematocriet wordt het deel van het bloed dat door rode bloedcellen wordt ingenomen bedoeld. Bovendien kan het kleine volume van het bloedsample bij de DBS-methode een nadeel zijn voor de gevoeligheid van de methode en voor het uitvoeren van meerdere analyses. [16] [17] [18] [19]

2.4 Analysetechniek

Bij de DBS-methode voor immunosuppressiva is een stap monstervoorbewerking aanwezig en een stap van analyse met Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). 2.4.1 Monstervoorbewerking

Bij Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus dient de medicijnconcentratie te worden vastgesteld in volbloed. Hierbij kan gebruik worden gemaakt van de DBS-methode. Omdat de immunosuppressiva zich voor een deel in de rode bloedcellen bevinden, dienen deze cellen gelyseerd te worden. Zowel bij de bestaande volbloedmethode zonder DBS als bij de ontwikkelde DBS-methode voor immunosuppressiva wordt hier een mengsel voor gebruikt van één deel 0,1 M zinksulfaatoplossing en twee delen methanol waarin de interne standaarden zijn opgelost. De functie van de zinksulfaatoplossing is het eenvoudig neerslaan van eiwitten (niet van toepassing bij DBS-methode) en het lyseren van de bloedcellen. Bij de DBS-methode wordt methanol gebruikt om de analyten van de DBS-kaart te extraheren. Deze monstervoorbewerking wordt “quick and dirty” genoemd. Hierbij wordt het supernatant geanalyseerd. [20]

Bloed bestaat voornamelijk uit water met daarin diverse mineralen, zouten, ionen, eiwitten en voedingsstoffen. Deze matrix kan negatieve effecten op de methode hebben. De matrixeffecten zouden vooral veroorzaakt worden door fosfolipiden en lysofosfolipiden doordat ze op vrijwel hetzelfde tijdstip als immunosuppressiva worden gedetecteerd.

20

Fosfolipiden en lysofosfolipiden bestaan uit een glycerolgroep waaraan twee vetzuurketens en een fosfaatgroep gebonden zijn. Ze hebben een hydrofiele “kop” en een hydrofobe “staart”. Fosfolipiden en lysofosfolipiden komen voor in membranen van cellen zoals rode bloedcellen. Een celmembraan bestaat uit een dubbele laag (lyso)fosfolipiden waarbij de hydrofobe staarten naar elkaar toe liggen in het midden en de hydrofiele koppen aan de buitenkant. Speciaal voor het verwijderen van (lyso)fosfolipiden in bloed heeft het merk Waters een zogenoemde Ostro-plaat op de markt gebracht. Een Ostro-plaat vermindert (lyso)fosfolipiden met meer dan 95%. Dit zou moeten leiden tot een schoner extract en minder matrixeffecten. [21] [22] [23]

2.4.2 Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) is een techniek waarbij Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) gecombineerd wordt met High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

2.4.2.1 Ultra Performance Liquid Chromatography

Bij HPLC worden ionen of moleculen in een mengsel gescheiden op basis van de affiniteit met de kolom (stationaire fase) en het eluens (mobiele fase). Als de componenten het einde van de kolom bereiken, worden ze overgedragen aan de massaspectrometer en geïoniseerd. De massaspectrometer scheidt de ionen op basis van de massa-ladingverhouding (m/z-ratio). Een tandem massaspectrometer kan het parent ion in verschillende fragmentatiepatronen fragmenteren en de fragmentionen scheiden. Met het parent ion wordt het geladen analytmolecuul bedoeld. In de omgeving van het bij het onderzoek gebruikte ammoniumhoudende eluens worden er ammoniumadducten gevormd. [24] [25]

Bij Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan er onder een hoge druk worden gewerkt (ca. 1000 bar) in tegenstelling tot HPLC (ca. 250 bar). Een hoge druk is het gevolg van een kleine deeltjesgrootte van de kolom. Kleinere deeltjes hebben het voordeel dat ze relatief een grotere oppervlakte hebben ten opzichte van het volume. Dit resulteert in een grotere scheidingscapaciteit. Een nadeel is echter dat door de grotere pakkingsdichtheid een hogere druk ontstaat. Bij UPLC wordt er dus een kolom gebruikt met kleinere deeltjes dan bij HPLC. Vaak wordt er gekozen voor een maximale elutiesnelheid waardoor UPLC sneller is dan HPLC en een vergelijkbare scheidingscapaciteit heeft. [24] [25]

2.4.2.2 Tandem Mass Spectrometry

Bij Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) worden ionen op basis van de m/z-ratio gescheiden. Voordat componenten de detector bereiken, komen ze in een interface. Deze interface is nodig om het analyt te ioniseren en het oplosmiddel te verdampen. Bij de UPLC-MS/MS die voor dit onderzoek wordt gebruikt, gebeurt dit door middel van Electrospray Ionization (ESI). Bij ESI wordt het eluaat onder atmosferische druk door een capillair geleid waarbij rondom het capillair een vernevelingsgas stroomt. Het uiteinde van het capillair is een fijne tip dat onderheven is aan een hoge potentiaal (ca. 3 - 4 kV). De vloeistof die door de fijne tip gaat, krijgt door het elektrisch veld een overmaat lading en bij het verlaten van de tip wordt de vloeistof verneveld tot geladen deeltjes. De geladen druppels worden, onderhevig aan elektrostatische krachten, door een tegenelektrode aangetrokken. Afhankelijk van de polariteit van de aangebrachte spanning zijn de resulterende analytionen positief of negatief geladen. Bij dit onderzoek is er sprake van positieve ionisatie. Als de druppels gevormd zijn, zal desolvatatie plaatsvinden en eluaat uit de druppels verwijderd worden. Dit wordt bevorderd door een verwarmde stikstofstroom.

21

De druppels worden hierdoor steeds kleiner zodat gelijke lading in een druppel steeds meer geconcentreerd wordt. Bij het overschrijden van een kritisch punt zullen de druppels exploderen en zullen er fijne aerosolen gevormd worden. Dit kritisch punt wordt bereikt wanneer in een druppel de elektrostatische krachten te groot worden ten opzichte van de oppervlaktespanning. Hierna wordt het aerosol geïntroduceerd aan de triple quadrupool van de massaspectrometer. Een quadrupool bestaat uit vier cilindervormige staven die evenwijdig liggen ten opzichte van elkaar en geplaatst zijn op de hoekpunten van een denkbeeldig vierkant. Een schematische weergave is te zien in figuur 5. Twee tegenover elkaar liggende staven dragen een positieve lading, de overige twee staven dragen een negatieve lading. Een ion dat het gebied tussen de vier staven binnenkomt, vibreert via een bepaald traject door de quadrupool. Bij MS/MS wordt er gebruik gemaakt van een triple quadrupool, een serie van drie quadrupolen. De eerste en derde quadrupool zijn scanquadrupolen terwijl de tweede quadrupool gebruikt wordt als botsingscel. Bij de eerste quadrupool wordt het te onderzoeken ion (“parent ion”) geselecteerd op basis van de m/z-waarde. Bij de tweede quadrupool wordt er botsingsgas (argon) toegevoegd waardoor de parent ionen botsen, worden geactiveerd en fragmenteren. Deze ontstaande fragmentionen worden gedetecteerd door de derde quadrupool. [24] [25]

Figuur 5: Schematische weergave quadrupool [26]

2.5 Validatie

Om te bewijzen dat de ontwikkelde methode aan de vooraf gestelde eisen voldoet, dient een methode te worden gevalideerd. Indien de resultaten van de validatie aan de gestelde eisen voldoen, is er sprake van een juist ontwikkelde methode en is het resultaat van een analyse betrouwbaar. Een validatie wordt uitgevoerd door verschillende parameters te onderzoeken, welke in paragraaf 2.5.1 t/m 2.5.10 worden beschreven.

2.5.1 Lineariteit

Lineariteit is het verband tussen concentratie en meetsignaal beschreven dor een lineaire vergelijking. Het concentratiegebied waarbinnen lineariteit is aangetoond, wordt meetbereik genoemd. Extrapolatie naar concentratie onder of boven het gevalideerde bereik is niet toegestaan. [27]

2.5.2 Limit of detection

Limit of detection (LOD) is de laagste concentratie die met gedefinieerde statistische waarschijnlijkheid kan worden aangetoond. Detectielimiet wordt ook wel aantoonbaarheidsgrens genoemd. [27]

22 2.5.3. Lower limit of quantification

Limit of quantification (LOQ) zijn de concentratiegrenzen die met gedefinieerde precisie en juistheid mogen worden gekwantificeerd. De laagste concentratiegrens wordt aangeduid met LLOQ (lower limit of quantification) en de hoogste concentratiegrens met ULOQ (upper limit of quantification). LLOQ en ULOQ worden ook wel bepalingsgrenzen genoemd. Het concentratiegebied binnen deze grenzen is het meetbereik. [27]

2.5.4 Herhaalbaarheid

Herhaalbaarheid is de mate van spreiding in meetwaarden verkregen met dezelfde methode, op hetzelfde sample, door dezelfde analist, met hetzelfde apparaat, op zo dicht mogelijk bij elkaar gelegen tijdstippen. [27]

2.5.5 Juistheid

Juistheid is de mate van overeenstemming tussen het gemiddelde van een reeks meetwaarden en de werkelijke waarde van te bepalen grootheid. De werkelijke (absoluut ware) waarde van een analyt is niet exact bekend of te bepalen. Daarom wordt vaak met een als werkelijk aangenomen (conventioneel ware) waarde gewerkt zoals bij referentiestandaarden. [27]

2.5.6 Reproduceerbaarheid

Reproduceerbaarheid is de mate van overeenstemming tussen de meetwaarden verkregen met dezelfde methode, op hetzelfde sample, door verschillende analisten, met verschillende apparaten, met verschillende batches reagentia, op verschillende tijdstippen, eventueel op verschillende laboratoria. [27] 2.5.7 Robuustheid

Robuustheid is de mate van gevoeligheid van meetwaarden voor al dan niet opzettelijk aangebrachte variaties in de omstandigheden en de methodevariabelen bij de uitvoering. Informatie over de kritieke parameters van een methode wordt verzameld tijdens de ontwikkeling en/of optimalisering van een methode. [27]

2.5.8 Carry-over

over is de mate waarop een hoge meetwaarde invloed heeft op de volgende meetwaarde. Carry-over kan worden veroorzaakt doordat na een analyse niet alle componenten van de kolom zijn vrijgekomen en ze bij de volgende analyse alsnog van de kolom af komen. Carry-over kan ook het gevolg zijn van het niet goed spoelen van de injectienaald en de sample loop. [27]

2.5.9 Houdbaarheid

Houdbaarheid is de mate van stabiliteit van standaarden, QC’s en patiëntsamples bij verschillende temperaturen en verschillende tijdsduren. [27]

2.5.10 Schaduwdraaien

Schaduwdraaien is de mate van overeenstemming tussen meetwaarden van patiëntsamples verkregen met een andere methode, op hetzelfde sample, eventueel door een andere analist, met een ander apparaat en op een ander laboratorium. [27]

23

3 Materiaal en methoden

In dit hoofdstuk wordt het materiaal en de methoden vermeld die gebruikt zijn bij het opzetten van de DBS-methode voor immunosuppressiva.

3.1 Chemicaliën

Acetonitril, Methanol LC-MS-kwaliteit en Mierenzuur ULPC/MS-kwaliteit zijn verkregen bij Biosolve. Ammoniumacetaat is verkregen bij Fluka. Zinksulfaat heptahydraat is verkregen bij Merck. Ciclosporine A is verkregen bij Fluka. Tacrolimus en Everolimus zijn verkregen bij Selleckchem. Sirolimus is verkregen bij Tebu-Bio. 13C2D2-Tacrolimus en 13C2D3-Sirolimus zijn verkregen bij Alsachim. Ciclosporine A-d4 en Everolimus-d4 zijn verkregen bij TRC. MilliQ-water werd verkregen bij Millipore. Vers volbloed en plasma werd verkregen bij Sanquin via het transfusielaboratorium van het Erasmus MC. Ook is er volbloed verkregen van patiëntsamples die voor gebruik gescreend zijn op het gebruik van immunosuppressiva via het medicatieoverzicht in het elektronische patiëntendossier.

3.2 Instrumenten

Er is gebruik gemaakt van een Waters Acquity UPLC (Binary Solvent Manager, Sample Manager, Sample Organizer, Column Manager). Aan deze UPLC is een triple quadrupool gekoppeld van Waters Micromass Quattro Premier ZE met ESI-probe. De gebruikte software is Masslynx en Quanlynx. De kolom die gebruikt werd, is een Waters Acquity UPLC BEH C18 kolom met een lengte van 50 mm, een doorsnede van 2,1 mm en een deeltjesgrootte van 1,7 µm. De analytische balans die werd gebruikt, is van Sartorius. De rollerbank is van Thermo Spiramix. Het Vortex-apparaat is van Scientific Industries. De microcentrifuge is van Eppendorf. Het ultrasoonbad is van Branson 3510. De positive pressure 96-processor waarmee de Ostro-plaat werd geanalyseerd, is van Waters. De reversed calibrated pipetten en repeteerpipetten zijn van Eppendorf. De positive displacement pipetten zijn van Gilson. De DBS-kaarten die werden gebruikt, zijn Bond Elut DBS DBS-kaarten van Agilent Technologies en 903 Protein Saver Snap Apart kaarten van Whatman. De puncher met een doorsnede van 3 mm is van Agilent Technologies. De puncher met een doorsnede van 6 mm is van Fiskars.

3.3 Eluentia

Er werden verschillende eluentia bereid: Eluens A, eluens B, strong wash, weak wash en seal wash. Voor de bereiding eluens A van eluens B werd eluensconcentraat gebruikt. Eluensconcentraat wordt bereid door 7,7 gram ammoniumacetaat op te lossen in 50 mL mierenzuur. Eluens A werd bereid door 1 mL eluensconcentraat aan 1 L MilliQ-water toe te voegen. Eluens B werd bereid door 1 mL eluensconcentraat aan 1 L LC-MS methanol toe te voegen. Strong wash bestaat uit 100% LC-MS methanol. Weak wash en seal wash werden bereid door 100 mL LC-MS methanol aan 900 mL MilliQ-water toe te voegen.

3.3 Standaarden en controles

Er werd gebruik gemaakt van twee verschillende soorten standaarden, QC’s en blanco volbloed: ingekocht en zelfgemaakt.

24

De bij Chromsystems ingekochte gevriesdroogde ‘MassCheck Immunosuppressant Whole Blood Control’ werden gereed gemaakt om als standaarden te gebruiken door ze te reconstitueren. Hiervoor werd er 2,0 mL MilliQ-water toegevoegd, 15 minuten laten staan en 15 minuten op de rollerbank gelegd. Er waren werkstandaarden van vier verschillende levels. De werkstandaarden werden per 60 uL uitgevuld in epjes en bewaard bij -20 °C.

De bij Recipe ingekochte gevriesdroogde ‘Whole Blood Control lyophilised for immunosuppressants’ werden gereed gemaakt om als QC’s te gebruiken door ze te reconstitueren. Hiervoor werd er 2,0 mL MilliQ-water toegevoegd, 15 minuten laten staan en en 15 minuten op de rollerbank gelegd. Er waren QC’s van drie verschillende levels. De QC’s werden per 60 µL uitgevuld in epjes en bewaard bij -20 °C. De bij Chromsystems ingekochte gevriesdroogde ‘MassCheck Immunosuppressants Whole Blood Blank Control’ werd gereed gemaakt om als blanco volbloed te gebruiken door ze te reconstitueren. Hiervoor werd er 2,0 mL MilliQ-water toegevoegd, 15 minuten laten staan en 15 minuten op de rollerbank gelegd. De blanco volbloed samples werden per 60 µL uitgevuld in epjes en bewaard bij -20 °C.

Zelfgemaakte standaarden en QC’s werden bereid door middel van stockoplossingen, tussenstockoplossingen en werkoplossingen. Voor de bereiding van de standaarden en QC’s werd gebruik gemaakt van dezelfde stockoplossingen. De stockoplossingen werden bereid door van Ciclosporine, Tacrolimus, Sirolimus en Everolimus circa 25,0 mg af te wegen, over te brengen in afzonderlijke maatkolven waarvan de volumes vermeld zijn in tabel 18 in bijlage I en aan te vullen met methanol. De stockoplossingen werden bewaard bij -20 °C.

Er werden vier tussenstockstandaarden bereid: vier concentratieniveaus met daarin alle vier componenten. De tussenstockstandaarden werden bereid door een deel van de stockoplossingen in 25 mL maatkolven te pipetteren en aan te vullen met MilliQ-water. Het pipetteerschema voor het bereiden van de tussenstockstandaarden is te zien in tabel 19 in bijlage I. De tussenstockstandaarden werden bewaard bij 5 °C. Voor elk concentratieniveau werden er afzonderlijke werkstandaarden met een hematocriet van 0,45 bereid. Bloed met een hematocriet van 0,45 werd bereid door vers volbloed te scheiden in rode bloedcellen en plasma en vervolgens 0,9 mL rode bloedcellen en 1,1 mL plasma bij elkaar te brengen. Deze bereiding wordt in tabel 20 in bijlage I weergegeven. De werkstandaarden werden bereid door aan 2 mL volbloed met een hematocriet van 0,45 20 µL tussenstockcontrole toe te voegen. Het pipetteerschema voor het bereiden van werkstandaarden is te zien in tabel 21 in bijlage I. Er werden drie tussenstockcontroles bereid: drie concentratieniveaus met daarin alle vier componenten. De tussenstockcontroles werden bereid door een deel van de stockoplossingen in 20 mL maatkolven te pipetteren en aan te vullen met MilliQ-water. Het pipetteerschema voor het bereiden van de tussenstockcontroles is te zien in tabel 22 in bijlage I. De tusenstockcontroles werden bewaard bij 5 °C. De werkcontroles werden bereid met verschillende hematocrietwaarden: 0,30, 0,45 en 0,60. De reden van het maken van controles met verschillende hematocrietwaarden is om te onderzoeken of het hematocriet invloed heeft op de te meten concentratie. Bloed met verschillende hematocrietwaarden werd bereid door vers volbloed te scheiden in rode bloedcellen en plasma en het vervolgens in de gewenste verhouding bij elkaar te brengen.

25

Het pipetteerschema voor de bereiding van bloed met verschillende hematocrietwaarden is te zien in tabel 20 in bijlage I. Voor elk concentratieniveau werden er afzonderlijke werkcontroles met drie verschillende hematocrietwaarden in duplo bereid, in totaal zes buizen per concentratieniveau. De werkcontroles werden bereid door aan 2 mL volbloed met een gedefinieerd hematocriet 20 µL tussenstockcontrole toe te voegen. Het pipetteerschema voor het bereiden van de werkcontroles is te zien in tabel 23 in bijlage I.

3.4 Extractieoplossing

Er werd gebruik gemaakt van twee verschillende extractieoplossingen: een mengsel van methanol/MilliQ-water 80:20 en een mengsel van methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1. De methanol/zinksulfaatoplossing wordt ook bij de volbloedbepaling voor immunosuppressiva zonder DBS gebruikt.

Methanol/MilliQ-water 80:20 werd bereid door 80 mL methanol te mengen met 20 µL MilliQ-water. Dit mengsel van methanol en MilliQ-water werd bewaard bij -20 °C.

Methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 bestaat voor een deel uit interne standaardoplossing. De interne standaard oplossing werd bereid door middel van stockoplossingen, tussenstockoplossingen en een werkoplossing. Er werd gebruik gemaakt van vier isotoop gelabelde interne standaarden: Ciclosporine A-d4, 13C2D3-Tacrolimus, 13C2D3-Sirolimus en Everolimus-d4. De interne standaard stockoplossingen werden bereid door van elke grondstof de gehele inhoud van het desbetreffende potje (ca. 1 mg) op te lossen in acetonitril in afzonderlijke 50 mL maatkolven. De stockoplossingen werden bewaard bij -20 °C. De tussenstockoplossingen werden bereid door een deel van de stockoplossingen in afzonderlijke 100 mL maatkolven te pipetteren en aan te vullen met acetonitril. Het pipetteerschema voor het bereiden van de interne standaard tussenstockoplossingen is te zien in tabel 24 in bijlage I. De tussenstockoplossingen werden bewaard bij -20 °C. De interne standaard werkoplossing werd bereid door van elke tussenstockoplossing 1 mL over te brengen in een 200 mL maatkolf en aan te vullen met methanol. De werkoplossing werd bewaard bij -20 °C. Methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 werd gemaakt door 100 mL 0,1 M zinksulfaatoplossing te mengen met 200 mL interne standaard werkoplossing. De methanol/zinksulfaatoplossing werd bewaard bij -20 °C.

3.5 Monstervoorbewerking

Er werd onderzocht of er beter DBS-kaarten van Agilent of Whatman konden worden gebruikt door op beide type kaarten in duplo 50 µL bloed te pipetteren van verschillende patiëntsamples die immunosuppressiva bevatten. De kaarten werden 2 uur bij kamertemperatuur gedroogd. Vervolgens werd er uit elke bloodspot een punch genomen met een doorsnede van 3 mm. Van elk patiëntsample werd er één punch opgewerkt met 200 µL 80:20 methanol/MilliQ-water, 150 µL interne standaard werkoplossing en 100 µL water, terwijl de andere punch werd opgewerkt met 700 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1. De mengsels werden enkele seconden gevortext en 5 minuten gecentrifugeerd bij maximale snelheid. Het supernatant werd overgebracht in een vial en geanalyseerd. De resultaten werden vergeleken aan de hand van de oppervlakten van de verkregen pieken.

26

Er werd ook onderzoek gedaan naar het beste te gebruiken type extractieoplossing: methanol/MilliQ-water 80:20 of methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1. Van ingekochte standaarden, QC’s en blanco volbloed werd er in duplo 50 µL op DBS-kaarten van Whatman gepipetteerd. De kaarten werden 2 uur bij kamertemperatuur gedroogd. Vervolgens is er uit elke bloodspot een punch genomen met een doorsnede van 3 mm. Van elke standaard, QC en blanco werd er één punch opgewerkt met 55 µL 80:20 methanol/MilliQ-water, 45 µL IS werkoplossing en 25 µL water als verdunning om de verschillende extractieoplossingen een vergelijkbaar percentage methanol te laten bevatten en om een zelfde volume extractieoplossing toe te voegen. De andere punch werd opgewerkt met 125 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1. De mengsels werden enkele seconden gevortext en 5 minuten gecentrifugeerd bij maximale snelheid. Het supernatant werd overgebracht in een vial met insert en geanalyseerd. De resultaten werden vergeleken aan de hand van de oppervlakten van de verkregen pieken.

Daarna werd er onderzocht of er beter een punch met een doorsnede van 3 mm of 6 mm kon worden gebruikt. Van ingekochte standaarden, QC’s en blanco volbloed werd er in duplo 50 µL op DBS-kaarten van Whatman gepipetteerd. De kaarten werden 2 uur bij kamertemperatuur gedroogd. Uit de bloodspots van elke standaard, QC en blanco werd er één punch genomen met een doorsnede van 3 mm, terwijl er uit de andere bloodspot een punch werd genomen met een doorsnede van 6 mm. Vervolgens werden de punches opgewerkt met 100 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1. De mengsels werden enkele seconden gevortext en 5 minuten gecentrifugeerd bij maximale snelheid. Het supernatant werd overgebracht in een vial met insert en geanalyseerd. De resultaten werden vergeleken aan de hand van de oppervlakten van de verkregen pieken en de lineariteit van de calibratielijn. Er werd verondersteld dat de piekoppervlakten voor een punch van 6 mm doorsnede hoger zouden zijn dan de piekoppervlakten voor een punch van 3 mm doorsnede doordat een grotere punch meer analyt kan bevatten en er dus meer kan worden geëxtraheerd.

Verder werd er onderzoek gedaan naar welk volume extractieoplossing er het beste kon worden toegevoegd. Van ingekochte standaarden, QC’s en blanco volbloed werd er in duplo 50 µL op DBS-kaarten van Whatman gepipetteerd. De DBS-kaarten werden 2 uur bij kamertemperatuur gedroogd. Vervolgens werd er uit elke bloodspot een punch genomen met een doorsnede van 6 mm. Van elke standaard, QC en blanco werd er één punch opgewerkt met 100 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1, terwijl de andere punch werd opgewerkt met 200 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1. De mengsels werden enkele seconden gevortext en 5 minuten gecentrifugeerd bij maximale snelheid. Het supernatant werd overgebracht in een vial met insert en geanalyseerd. De resultaten werden vergeleken aan de hand van de oppervlakten van de verkregen pieken en de lineariteit van de calibratielijn. Er werd verondersteld dat de piekoppervlakten voor 100 µL methanol/zinksulfaatoplossing hoger zouden zijn dan de piekoppervlakten voor 200 µL methanol/zinksulfaatoplossing doordat een kleiner volume extractieoplossing de samples minder verdunt.

Uit de voorgaande onderzoeken werd een voorlopige conclusie getrokken over de meest geschikte monstervoorbewerking. Hierbij werd er 50 µL sample op de aangegeven plaats op een DBS-kaart van Whatman gepipetteerd om het daarna 2 uur bij kamertemperatuur te laten drogen. Vervolgens werd er uit elke bloodspot een punch genomen met een doorsnede van 6 mm.

27

Hieraan werd 100 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 toegevoegd om het daarna enkele seconden te vortexen en 5 minuten bij maximale snelheid te centrifugeren. Het supernatant werd overgebracht in een vial met insert en geanalyseerd. Hierbij werd gebruik gemaakt van ingekochte standaarden en QC’s van respectievelijk Chromsystems en Recipe.

Wanneer deze monstervoorbewerking bij patiëntsamples werd toegepast bij gebruik van ingekochte standaarden voor de calibratielijn, leidde dit tot afwijkende medicijnconcentraties ten opzichte van de volbloedmethode voor immunosuppressiva zonder DBS. Als gevolg daarvan werd er overgestapt op het zelf maken van standaarden door vers volbloed te spiken. Er is toen gebruik gemaakt van een Ostro-plaat om fosfolipiden te verminderen. Dit had echter geen invloed op de afwijkingen van de patiëntsamples. Ook is er onderzocht wat de invloed van ultrasoneren is. Door te ultrasoneren kwamen de medicijnconcentraties van de patiëntsamples meer in de buurt van de concentraties die met de volbloedmethode zonder DBS waren bepaald, maar de concentraties waren nog steeds te hoog. Er werd toen teruggegaan naar het gebruik van ingekochte standaarden en QC’s en het hierbij toepassen van een correctiefactor.

Bij de uiteindelijke monstervoorbewerking werd er 50 µL sample op de aangegeven plaats op een DBS-kaart van Whatman gepipetteerd. Deze werd 2 uur bij kamertemperatuur gedroogd. Vervolgens werd er uit elke bloodspot een punch genomen met een doorsnede van 6 mm. Hieraan werd 200 µL methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1 toegevoegd om het daarna enkele seconden te vortexen en 15 minuten bij 60 °C te ultrasoneren. Er werd niet meer gecentrifugeerd omdat bij voorgaande keren geen neerslag te zien was. Het supernatant werd overgebracht in afzonderlijke vials met insert. Hierbij werd gebruik gemaakt van ingekochte standaarden en QC’s van respectievelijk Chromsystems en Recipe. Deze monstervoorbewerking is ook toegepast bij de validatie van de methode.

3.6 LC-MS/MS-instellingen

De LC-MS/MS-instellingen die bij elke analyse werden gebruikt, werden overgenomen van de bestaande volbloedmethode voor immunosuppressiva zonder DBS. Het gaat immers om dezelfde componenten. In de tabellen 25 en 26 in bijlage II zijn de instellingen voor respectievelijk UPLC en MS/MS vermeld. Een chromatogram met de verwachte retentietijden van de pieken is te zien in figuur 32 in bijlage II.

3.7 Validatie

De validatie van de DBS-methode bestond uit zes validatiedagen waarbij er verschillende parameters werden onderzocht. De wijze waarop de validatie plaats heeft gevonden, werd gebaseerd op de procedure “Validatie Analytische Methode (VAM) Gehaltebepaling van geneesmiddel in biologisch materiaal” [27] van het Erasmus MC kwaliteitshandboek. In deze procedure stonden ook de eisen vermeld waaraan de validatie diende te voldoen.

Na een analyse werden de benodigde meetwaarden ingevuld in de validatie-spreadsheet voor de validatie van kwantitatief onderzoek binnen het apotheeklaboratorium van het Erasmus MC. Deze validatie-spreadsheet rekent onder andere met de respons. De respons wordt berekend door de piekoppervlakte van het analyt te delen door de piekoppervlakte van de interne standaard.

28

Bij elke validatiedag werd er gebruik gemaakt van eluentia die op één en dezelfde dag waren bereid om uit de sluiten dat deze factor voor eventuele afwijkingen in de analyses kon zorgen. Hetzelfde geldt voor de bereiding van methanol/0,1 M zinksulfaatoplossing 2:1.

3.7.1 Lineariteit

De lineariteit werd bepaald door standaard 1 t/m 4 in duplo te meten. Er werd ook een blanco (zonder interne standaard) en een 0-sample (blanco met interne standaard) gemeten. Het verschil tussen de theoretische concentratie en de gemeten concentratie diende voor elke standaard afzonderlijk kleiner te zijn dan 15% en bij de LLOQ kleiner dan 20%.

De respons werd uitgezet tegen de gemeten concentratie. Er werd lineaire, least-square-regressie uitgevoerd op de curve. Hierbij werd de ijklijn doorgaans niet geforceerd door de oorsprong, maar werd de oorsprong wel als meetpunt meegenomen. De meetpunten dienden random verdeeld te zijn rond residual = 0% en er dienden geen patronen aanwijsbaar te zijn. Indien het concentratieverschil binnen de ijklijn meer dan één decade bedroeg, werd de wegingsfactor 1/x toegepast. Hierin was ‘x’ de gemeten concentratie van de betreffende standaard. Dit gold alleen wanneer de lagere concentraties het therapeutisch gebied van de analyt omvatten en de hogere concentraties het toxische gebied betroffen. De correlatiecoëfficiënt (r) diende groter te zijn dan 0,995. De determinatiecoëfficiënt (r2) diende groter te zijn dan 0,990.

3.7.2 Limit of detection

De LOD werd bepaald door op vijf verschillende dagen een blanco met interne standaard te meten. Hiervan werd het gemiddelde en de standaarddeviatie van de respons berekend. De LOD was gedefinieerd als de concentratie behorend bij de gemiddelde respons van de blanco + 3 maal de standaarddeviatie.

3.7.3 Lower limit of quantification

De LLOQ werd bepaald door op zes verschillende dagen een zogenoemde LLOQ-standaard te meten. De concentratie van deze LLOQ-standaard diende lager te zijn dan de concentratie van de laagste standaard van de calibratiereeks. De LLOQ-standaard werd bereid door standaard 1 1:1 te verdunnen met blanco volbloed. Er werd het gemiddelde en de standaarddeviatie van de respons van de LLOQ-standaard berekend. De LLOQ was gedefinieerd als de concentratie behorend bij de gemiddelde respons van de LLOQ-standaard + 10 maal de standaarddeviatie. De LLOQ diende lager te zijn dan de laagste standaard van de calibratiereeks en lager dan de ondergrens van de therapeutische range.

3.7.4. Herhaalbaarheid

De herhaalbaarheid werd bepaald door QC 1 t/m 3 in zesvoud te meten. Van elk concentratieniveau werd de relatieve standaarddeviatie van de gemeten concentraties van de QC’s berekend. De relatieve standaarddeviatie diende voor elk concentratieniveau afzonderlijk kleiner te zijn dan 15%.

3.7.5. Juistheid

De juistheid werd bepaald door QC 1 t/m 3 in zesvoud te meten. Het verschil tussen de theoretische concentratie en de gemeten concentratie diende voor elke concentratieniveau afzonderlijk kleiner te zijn dan 15%.