Het effect van invriezen op de dynamische viscositeit van de nucleus pulposus

Het effect van invriezen op de dynamische viscositeit van de

nucleus pulposus

Citation for published version (APA):

Paar, L. P. C. (1995). Het effect van invriezen op de dynamische viscositeit van de nucleus pulposus. (DCT rapporten; Vol. 1995.058). Technische Universiteit Eindhoven.

Document status and date: Gepubliceerd: 01/01/1995

Document Version:

Uitgevers PDF, ook bekend als Version of Record

Please check the document version of this publication:

• A submitted manuscript is the version of the article upon submission and before peer-review. There can be important differences between the submitted version and the official published version of record. People interested in the research are advised to contact the author for the final version of the publication, or visit the DOI to the publisher's website.

• The final author version and the galley proof are versions of the publication after peer review.

• The final published version features the final layout of the paper including the volume, issue and page numbers.

Link to publication

General rights

Copyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright owners and it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights. • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain

• You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal.

If the publication is distributed under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license above, please follow below link for the End User Agreement:

www.tue.nl/taverne Take down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us at: openaccess@tue.nl

providing details and we will investigate your claim.

Het effect van invriezen op de dynamische viscositeit van

de nucleus pulposus

L.P.C. Paar WFW-Rapport 95.058

Stageverslag April 1995

Stagebegeleider: Dr. Ir. M.R. Drost

Vakgroep Bewegingswetenschappen Faculteit Gezondheidswetenschappen

Rijksuniversiteit Limburg

en

Vakgroep Fundamentele Werktuigkunde Faculteit Werktuigbouwkunde Technische Universiteit Eindhoven

SAMENVATTING

Bij de vakgroep Bewegingswetenschappen aan de Rijksuniversiteit Limburg wordt onderzoek verricht naar het mechanisch gedrag van de tussenwervelschijf. Omdat niet al het biologisch materiaal dat er beschikbaar is meteen gebruikt kan worden bij het onderzoek, wordt er een gedeelte in de diepvries gelegd om het voor langere tiju te kinnen bewaren. In het kadeï vaïì het ûiìdeïzûek is de vraag geïezen of het bewuer, ir, de

diepvries van biologisch materiaal (tussenwervelschijf in het bijzonder) effecten heeft op de mechanische

eigenschappen van het materiaal.

In dit rapport wordt een beschrijving gegeven van de dynamische viscositeitsmetingen die zijn verricht met de RFS-I1 (Rheometrics Fluid Spectrometer-11) op nucleus pulposus materiaal van honden. Het nucleus

pulposus materiaal is ingedeeld in 4 categorieën: diepgevroren, N2 bevroren, gekoeld en vers. Met deze

indeling is het mogelijk om de diverse effecten met elkaar te vergelijken.

De nucleus pulposus proefstukken vertonen shear-thinning gedrag: een dalende viscositeit bij toenemende (effectieve) afschuifsnelheid. Elk proefstukje zal dan ook een eigen waarde voor de slope (helling) en intercept (basisniveau) hebben. Om toch vergelijkingen te kunnen maken tussen de verschillende metingen zijn de gemiddelde waarden voor de slope en de intercept per categorie uitgerekend.

De slope is redelijk constant en bevindt zich tussen de -0.71 en -0.76, voor de intercept zijn de variaties groter. De gemiddelde intercept voor verse proefstukjes bedraagt 2.89, voor diepgevroren proefstukjes 2.79,

N2 bevroren proefstukjes 2.40 en gekoelde proefstukjes 2.47 (waarden van de gemiddelde intercept in 'go,).

Er bestaat hier dus een factor 1.26 (bij reële waarden) verschil tussen diepgevroren en verse proefstukken. Eerdere metingen (Van Driel, 1994) gaven een factor 72 verschil te zien.

Het verschil wordt waarschijnlijk veroorzaakt door twee effecten: uitdroging van de gehydrateerde proteoglycanen naarmate de tijd verstrijkt dat het proefstuk in de diepvries ligt en beschadiging van de collageen vezels door de mechanische belasting die ontstaat bij het invriezen.

I n h d INHOUD SAMENVATTING

. . .

. . .

. . .

1 1.INLEIDING

. . .

3 2 . MATERIALEN EN METHODEN

. . .

5 2.1 Inleiding

. . .

5

2.2 Proefstuk preparatie

. . .

5 2.3 Meetprocedure

. . .

6 2.3.1 De plaat-plaat geometrie

. . .

7 2.4 Meetprotocol

. . .

7 2.4.1 Proefstuk gegevens

. . .

9 2.5 Statistische verwerking

. . .

10

2.6 Nauwkeurigheid van de meting

. . .

11

3.RESULTATEN

. . .

12

3.1 Condens vorming

. . .

12

3.2 De reproduceerbaarheid

. . .

12

3.3 Resultaten dynamische metingen

. . .

13

4.DISCUSSIE

. . .

17

4.1 Algemeen

. . .

17

4.2 Shear-thinning gedrag van de nucleus pulposus

. . .

17

4.3 Verse en gekoelde metingen

. . .

17

4.4 N, Bevroren en diepgevroren metingen

. . .

18

4.5 N, Bevroren en diepgevroren versus verse metingen

. . .

20

4.6Evaluatie

. . .

22

5

.

CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN

. . .

23

5.1Conclusies

. . .

23

5.2 Aanbevelingen

. . .

23

1.

INLEIDING

Aan de Rijksuniversiteit Limburg in Maastricht speelt al enige tijd de vraag of het invriezen van proefstuk- ken geen gevolgen heeft op de eigenschappen van het materiaal. Het is namelijk de vraag of de biologische materialen misschien "kapot vriezen" doordat het water, wat een zeer groot bestanddeel is van de meeste moiogische materialen, uitzet bij bevriezing. Eei is belangrijk urn dit uit ie zoeken omdat vee! vûii de bij

onderzoek gebruikte biologische materialen, voordat ze onderzocht worden, ingevroren zijn geweest. De "tussenstap" van invriezen wordt veelvuldig toegepast om biologisch materiaal voor langere tijd te bewaren. Om dit effect te testen is er in dit rapport gekozen voor nucleus pulposus materiaal. Er is voor nucleus pulposus materiaal gekozen omdat het bestaat uit een netwerk van collageenvezels (zeer lange en dunne vezels) dat ingebed ligt in een grondsubstantie van gehydrateerde proteoglycanen (waterbindende moleculen) en derhalve voor 70

-

90 % uit water bestaat.

Er is al een keer aandacht aan dit fenomeen geschonken in een afstudeer-onderzoek door Van Drie1 (1994).

Hierin werden echter zeer grote verschillen tussen vers en diepgevroren materiaal gevonden voor de intercept

(=basisniveau). Voor het diepgevroren materiaal was de gemiddelde intercept 2.65 en voor het verse

materiaal 0.79, beiden bij een afschuifrek van 1%. Het is nu dus zaak om te achterhalen wat nu de oorzaak van het grote verschil in de meetwaarden is, wat uit het afstudeerverslag van Van Drie1 naar voren komt. Er

zijn namelijk twee mogelijke verklaringen voor wat betreft Van Drie1 z'n bevindingen. Het is mogelijk dat

het invriezen van biologisch materiaal werkelijk desastreus is voor het materiaal, maar het is ook mogelijk dat bij de proefstukpreparatie van de verse proefstukjes niet zorgvuldig genoeg met het kwetsbare materiaal is omgegaan.

Het doel van het onderzoek is om met behulp van de Rheometrics Fluid Spectrometer-I1 (RFS-11) de dynamische viscositeit te bepalen van bevroren en verse nucleus pulposus proefstukken om via deze weg beschadigingen (ontstaan door het invriezen) in het materiaal op te sporen.

Nu is het duidelijk dat eik proefstuk anders is (anciere tussenwervelschijf, andere hond, verschillende ouderdom van de honden, etc.), daarom is er gezocht naar een oplossing voor dit probleem. De uiteindelijke oplossing is redelijk eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren. Er wordt een vers proefstuk genomen waar men metingen op verricht, vervolgens bevriest men het met vloeibaar stikstof en kunnen er weer metingen worden verricht na opwarmen tot 37 "C.

Om de effecten van het invriezen te beproeven zijn de geteste proefstukjes ingedeeld in één van de

onderstaande categorieën :

- diepgevroren

< .

dit betekent dat de gehele wervel, waar de proefstukjes dus nog in zitten, gedurende minimaal twee weken in een diepvries hebben gelegen.

dit betekent dat het proefstukje op de Rheometrics is afgekoeld met stikstof tot het een

temperatuur heeft bereikt van - 25 "C, en daarna weer laten opwarmen tot 37 "C.

dit betekent dat de wervels gedurende hooguit 5 dagen in de koelkast (+ 4 "C) hebben gelegen alvorens er proefstukjes zijn uitgehaald.

- N, bevroren

- vers dit betekent dat deze wervels gedurende hooguit één dag in de koelkast hebben gelegen.

Er is een onderscheid gemaakt in deze categorieën om een duidelijk onderscheid tussen de verschillende

soorten proefstukjes te krijgen waarbij het uiteindelijk mogelijk zal zijn om uitspraken te doen betreffende het vooraf gestelde doel, het bepalen van het effect van invriezen op de dynamische viscositeit van de

ngc!em niilnnciic

Y"'Y""-"'

Tijdens het N2 bevriezen van de proefstukjes blijkt er in enige mate condensvorming op ie treden. Om het

effect van het condenseren op de dynamische viscositeit van de nucleus pulposus te testen, wordt er ook nog een Dynamic Time Sweep Default Test (DTSDT) gedaan.

2.

MATERIALEN EN METHODEN

2.1 Inleiding

expenmenten bestaan dynmisciie meirrigen aaiï de nuc~eus p - ~ ~ i i o s u s ~ n- Y G - - - - ~ - A . . L L - - ~ 1 U C l S L U M G l I LIJ11 -:i- afkÛmS~g

uit de wervelkolommen van 4 honden (3 herdershonden en 1 bouvier), afkomstig van de vakgroep

Cardiologie aan de Rijksuniversiteit Limburg (RL).

De experimenten zijn verricht op de Rheometrics Fluid Spectrometer-I1 (RFS-11, Rheometrics Inc.) van de

vakgroep Fundamentele Werktuigbouwkunde aan de Technische Universiteit Eindhoven (TUE).

Bij de metingen is onderscheid gemaakt tussen diepgevroren, N2 bevroren, gekoelde en verse proefstukken.

2.2 Broefstuuk preparatie

De proefstuk preparatie is onder te verdelen in drie stappen, te weten: 1. het uitnemen van de wervelkolom;

2. het eventueel in stukken zagen van de wervelkolom;

3. het uitnemen van de nucleus pulposus.

Het uitnemen van de wervelkolom (stap 1) vindt een half tot drie uur na het overlijden van het proefdier plaats. Daartoe word de huid, aan de rug zijde, ter hoogte van de onderste rib tot aan het begin van de staart opengesneden. De wervelkolom is vrijgemaakt door alle weefsels (oa. bind- en vetweefsel) met een scalpel te verwijderen. Vervolgens is de wervelkolom met behulp van een oscillerende zaag doorgezaagd om

vervolgens uitgenomen te kunnen worden (natuurlijk moet ook hierbij vet-, bind- en spierweefsel worden

doorgesneden). Na het uitnemen van het stuk wervelioiom waren er 3 mogelijkheden:

a) inpakken en in Maastricht in de diepvries bij -65 "C bewaren;

b) inpakken en in de koelkast (+4 "C) leggen;

c) inpakken en in een koelbox naar Eindhoven vervoeren om aldaar direct te worden

geprepareerd om metingen te verrichten of om vervolgens daar in de koelkast te worden

bewaard en de dag erna geprepareerd te worden.

Als het voor de geplande meting nodig was, dan is de wervelkolom ook nog in stukken gezaagd met een

gewone ijzer(hand)zaag (stap 2). Dit is om dan bijvoorbeeld van één wervelkolom diepgevroren èn gekoelde proefstukjes te krijgen.

De laatste stap is dan het uitnemen van de nucleus pulposus (stap 3). Daartoe wordt eerst al het vet-, bind- en spierweefsel van dat gedeelte van de wervelkolom verwijderd rond de tussenwervelschijf. Vervolgens

-wd

worden de kapsels om de facetgewrichtjes losgesneden. Als dit gebeurd is zitten de twee wervels, waar de tussenwervelschijf tussen zit, alleen nog maar met elkaar verbonden door middel van de tussenwervelschijf.

Het is nu dus mogelijk om de nucleus pulposus bloot te leggen door de tussenwervelschijf van de wervel los

te snijden met een scalpelmes. Het is hierbij belangrijk om het enigszins gebogen oppervlak van de wervel goed te volgen met het scalpelmes zodat de nucleus pulposus niet wordt doorkliefd. Na deze handelingen is

er e m wervel met tussenwervelschijf (bestaande uit anulus fibrosus en nucleus pulposus) vrijgekomen. Het is nu zaak om met het scalpel heel voorzichtig anulus fibrosus en nucleus pulposus te scheiden. Dit is nood- zakelijk doordat de nucleus pulposus en de anulus fibrosus geleidelijk in elkaar over gaan en dus niet, zoals

in sommige illustraties getoond wordt (figuur 2. l), twee onafhankelijke weefsels zijn.

Figuur 2.1 een slechte illustratie

4NNÙLUS LAMINATES

iguur 2.2 een goede illustratie

Nu is het mogelijk om de nucleus pulposus, die los in de anulus fibrosus ligt, met behulp van het scalpel van de wervel af te rollen (voorzichtig zonder rekken te veroorzaken) op een metalen folie, de folie van het

scalpelmesje (Swann-Morton, sterile surgical blade), waarop het vervolgens naar de RFS-I1 wordt vervoerd.

2.3 Meetprocedure

De experimenten zijn uitgevoerd met de RFS-I1 van de TUE in Eindhoven. Dit is een dynamische

viscosimeter die gebruik maakt van het “gap-loading’’ meetprincipe (zie figuur 2.3).

Proefstukje Water

I

7

Bij dit meetpnncipe bevindt het proefstuk zich tussen twee platen. Op de onderste plaat wordt de vervorming (sinusvormig) aangelegd en op de bovenste, stilstaande, plaat wordt vervolgens het resulterende moment en het faseverschil tussen de kracht en de vervorming gemeten. Alle andere visco-elastische parameters, zoals de dynamische modulus en de dynamische viscositeit, kunnen hieruit worden berekend. Er is gewerkt met de plaat-plaat geometrie met een bevochtigingskamer. De normaalspanningen zijn niet gemeten.

2.3.1 De piaat-plaat geometrie

Voor de metingen aan nucleus pulposus proefstukken is gebruik gemaakt van de plaat-plaat geometrie. De

onderste en de bovenste plaat hebben een diameter van 50 mm. Het proefstukje wordt dan op het middelpunt

van de onderplaat gelegd (dit is een zichtbaar puntje) door de folie om te vouwen net voor het proefstukje en

vervolgens het proefstukje weer met behulp van het scalpelmesje er van af te rollen. Er is bij deze opstelling gebruik gemaakt van een glazen bovenplaat zodat wanneer het proefstukje op zijn plaats ligt het nog

mogelijk is om de diameter te meten met een schuifmaat (Mitutoyo). De diameter wordt bepaald door te

kijken wat de diameter van het proefstukje is, wanneer het hechtings oppervlak van het proefstuk aan de platen aan de boven en onderzijde gelijk is na aandraaien van de bovenplaat. Verder is dan natuurlijk de bepaling van de diameter nog in enige mate een schatting, door het feit dat een nucleus pulposus van nature per definitie niet rond maar ovaal is. De meting van de diameter is het gemakkelijkste te doen door de schuifmaat boven de glasplaat te houden en dus van bovenaf te meten (let op dat de schuifmaat niet te zeer op de bovenplaat drukt, er kunnen dan te grote normaalkrachten optreden die de RFS-I1 niet kan verdragen). De hoogte is bepaald met een op de RFS-I1 geplaatste micrometer. Op de onderste plaat is de bevochtigings- kamer vastgelijmd, om 100% luchtvochtigheid te verkrijgen (het proefstuk staat dus niet in rechtstreeks contact met het water).

2.4 Meetpïotoco!

De uitgevoerde dynamische metingen zijn zgn. "Dynamic frequency sweep default tests"

.

Bij een frequency

sweep wordt het proefstuk aan een afschuifrek

y

(t) met een variërende hoekfrequentie O (IO-' tot 10' rad's)

en een specifieke amplitude van de afschuifrek

yo

(1% en

5%,

of alleen 1%) onderworpen.

In tabel 2.1 zijn de proefstuk gegevens weergegeven. Metingen die mislukt zijn of niet relevant voor het

uiteindelijke doel van deze stage zijn weggelaten. Een meting wordt als mislukt aangemerkt wanneer reeds bij het prepareren of het plaatsen op de RFS-I1 wordt geconstateerd dat het proefstuk niet goed is, m.a.w. er is niet na de metingen pas een selectie gemaakt wat goed is en wat slecht. De metingen zijn bij een tempera- tuur van 37 "C uitgevoerd.

Elke dag dat er metingen zijn verricht zijn de volgende stappen doorlopen :

-

het aanzetten van de meetapparatuur (RFS-I1 en de computer);

- het op nul stellen van de hoogte meter;

- water in de bevochtigingskamer brengen en bevochtigingskamer afsluiten met een dekseltje.

Dit is dus vantevoren zo klaar gezet, het prepareren komt nu aan de orde. Het proefstukje wordt dan ook pas

nu uit de tussenwervelschijf gehaald die nog steeds door 2 wervels wordt omsloten omdat het materiaal

anders al zou kunnen uitdrogen. Het uitnemen duurt ongeveer 30 min en in deze tijd is de luchtvochtigheid

in de bev~chtigingsk.mer !!IO% gewnrden. Nii volgt de rest van het protocol :

- afnemen van het dekseltje van de bevochtigingskamer;

-

het plaatsen van het proefstukje op de RFS-11;

- het meten van de diameter met een schuifmaat;

-

terug leggen van het dekseltje op de bevochtigingskamer;

-

het instellen van de meting;

- een half uur wachten;

- het starten van de meting;

-

het opslaan van de meetgegevens.

Aangenomen wordt dat binnen een half uur een homogene temperatuurverdeling ontstaat in het proefstukje.

Tijdens de stage is gebleken dat het gemakkelijk zou zijn om aan een en hetzelfde proefstukje een verse en een diepgevroren meting te verrichten om een zo eerlijk mogelijke vergelijking van meetresultaten te

verkrijgen. Het is nu echter niet mogelijk om een eenmaal op de RFS-I1 aangebracht proefstukje, zonder het

te beschadigen, er weer af te halen. De enige oplossing die mogelijk is, is dus om het proefstukje op de

RFS-I1 te "bevriezen" met N,. Er is daarom een protocol ontwikkeld voor deze procedure. Dit protocol ziet er dan als volgt uit :

- zet instel-temperatuur op O "C, dit is om een foutmelding van de RFS-I1 in verband met een te grote temperatuurdaling te voorkomen,

-

neem dekseltje vari de bevochtigiingskamer a€,

-

haal water uit de bevochtigingskamer (gaat het gemakkelijkste met een tissue),

-

giet vloeibaar stikstof in de bevochtigingskamer en lees de temperatuur op de computer die

aan de RFS-11 gekoppeld is af tot deze een waarde van -25 "C heeft bereikt,

- stel vervolgens de temperatuur weer in op 37 "C en voeg weer water toe om 100% luchtvochtigheid te

verkrijgen, doe dit wel voorzichtig want de onderplaat kan door condens vorming los zijn komen te zitten,

- terug leggen van het dekseltje op de bevochtigingskamer;

-

wacht een half uur en start de meting.

Tijdens het ontdooien na het bevriezen treedt er echter condensvorming op en dit gebeurt natuurlijk ook op het proefstukje zelf. Zoals waarschijnlijk wel bekend zal zijn, zwelt nucleus pulposus materiaal bij contact met water. Dit zou consequenties kunnen hebben voor de dynamische viscositeits metingen op het materiaal.

en 9 7 8 9 10 11

gebracht met een druppel water (zie figuur 2.4).

C herder L3-L4 37 - 42 37,41 D bouvier L3-L4 43 - 46 43,46 D bouvier T12-LI 47 - 49 D bouvier L2-L3 50 - 54 50 D bouvier L 1 -L2 55 - 60 55, 57 Proefstukje Water I

Figuur 2.4 Proefstukje in contact met water.

Met deze proefopstelling is daarna een meting verricht, dit is een Dynamic Time Sweep Default Test

(DTSDT) gedurende 10 min. met een dynamische frequentie van 10 raas (dus de frequentie blijft

onveranderd) en 1% rek. Deze test maakt het mogelijk om in een vastgesteld tijdsinterval meting te doen van

de dynamische viscositeit met gelijkblijvende testcondities.

2.4.1 Proefstuk gegevens

Mat- en

Zoals uit tabel 2.1 blijkt zijn niet alle verrichtte metingen gebruikt. De gegevens van de relevante metingen staan, in meer gespecificeerde vorm, in tabel 2.2.

meting nr. toestand diameter mm "gap" (hoogte) mm

55

41

46

57

diepgevroren 11.3 2.70

N, bevroren onbekend onbekend

N, bevroren 11.0 2.46

N, bevroren 11.3 2.70

8

25 37

Tabel 2.2 Proefstuk gegevens van de gebruikte metingen

2.5 Statistische verwerking

gekoeld 9.1 2.26

gekoeld 6.7 1.66

gekoeld onbekend onbekend

opmerkingen

meting van de hoogte nog niet m-o-

gelijk met de micrometer, minimaal 2 maanden in de diepvries gelegen

50

6 dagen in diepvries gelegen, ovaal

vers 9.5 3.10

15 dagen in diepvries gelegen, ovaal enige extra rek bij prepareren, en na bevriezing ondervonden

heel vers, 4 uur na uitnemen van de

wervelkolom

~

ovaal

enige extra rek bij prepareren gehad

heel vers, 4 uur na uitnemen van de

wervelkolom

Na de meting is met behulp van het software pakket Statgraphics 5.0 van de relevante metingen de slope en

de intercept bepaald. Dit is gebeurd met gebruikmaking van de functie Regression Analysis, met een Multiplicatief model (y=axb). De uitkomsten hiervan staan in tabel 2.3 vermeld.

meting nr. slope intercept

i2

1 -0.72 3.12 0.999 -0.73

1

2.44

I

0.997

1

diepgevroren specificatie diepgevroren 41 -0.66 1.97 0.988

N,

bevroren 46 -0.75 2.54 0.998

N,

bevroren 57 -0.73 2.68 0.998

N,

bevroren 8 -0.73 2.48 0.998 gekoeld 25 -0.72 2.57 0.997 gekoeld 37 43 -0.71 2.36 0.995 gekoeld -0.77 2.80 0.998 vers

Tabel 2.3 Statgraphics gegevens van de gebruikte metingen (waarden van intercept in 'qog). 50

2.6 Nauwkeurigheid van de meting

-0.75 2.98 0.998 vers

De nauwkeurigheid van de meting heeft z'n begrenzingen. Zo is het bepalen van de diameter een schatting

omdat het materiaal meestal niet rond maar meer ovaal is en verder wordt de bepaling van de diameter bemoeilijkt doordat er tussen materiaal en schuifmaat de glazen bovenplaat zit. De bepaling van de hoogte

dient ook afgerond te worden, want hoewel de hoogte met een micrometer wordt afgelezen, is de bepaling

van de juiste hoogte (hechtings oppervlak aan boven- en onderplaat is gelijk) een afschatting doordat de

juiste positie me: het blote oog wordt hepza!d. Vmdzar worden alle metingen en stztistische gegevens op

3.

RESULTATEN

3.1 Condens vorming

Eij het N2 bevriezen var1 het riucieüs yülyosüs mateïiaal biijkt e ï bij het û ~ x i m m ì , iiâ het tij: - 25 "C :e hebben afgekoeld, condens vorming op te treden. Een Dynamic Time Sweep Default Test leidt dan tot het volgende resultaat (figuur 3.1).

grafiek van meting 58

tijd [SI

Figuur 3.1 Condensatie-test met nucleus pulposus

De dynamische viscositeit neemt toe van 725 Pa.s tot 756 Pa.s op tijdstip t = 600 sec bij een frequentie van

10 raas. Tijdens de 10 min. dat het proefstukje in het water ligt zwelt het nucleus pulposus materiaal met

een ovale doorsnede van 1 2 ~ 1 0 . 3 mm naar 1 4 ~ 1 2 . 5 mm.

3.2 De reproduceerbaarheid

Het is van belang dat de op een proefstuk uitgevoerde metingen geen schade aan het materiaal toebrengen waardoor vervolg metingen onbetrouwbaar worden. Daarvoor zijn er allereerst een aantal metingen verricht om de invloed van de rek te bekijken. Deze metingen zijn te zien in figuur 3.2 en 3.3 op de volgende pagina. Figuur 3.1 illustreert twee metingen van 1% rek aan hetzelfde proefstukje. Tussen deze metingen door zijn er

nog andere metingen verricht met een grootste rek van 5%. De slope van meting 8 is -0.73 tegen -0.72 bij

allebei 1% metingen aan hetzelfde proefstukje, maar nu is tussendoor een meting met een rek van 50%

geweest. De slope wordt dan -0.72 versus -0.68 en de intercept 3.12 versus 2.96.

101 7 ~ I%rek * o I D * o . O 103 ' 0 I: _{* o} 1% q k na een 50% rek 1 ' 0 I O I D * u 102: * o . o 3,

'10-I

' ' ' " " " 1 00 ' ' ' " ' . " 10' ' ' ' " " ' 10'

Graft& van meling8 vergeleken mcl meiingi2

meting nummer slope intercept

1 vs. 2 -0.72 - -0.73 3.12 - 3.13 8 vs. 10 -0.73 - -0.71 2.48 - 2.46 18 vs. 19 -0.73 - -0.73 2.44

-

2.44 30 vs. 31 -0.77 - -0.77 2.88

-

2.87 37 vs. 38 -0.71 - -0.71 2.36 - 2.34 47 vs. 48 -0.78 - -0.78 3.00 - 2.99 102: tussenliggende metingen geen 1% rek meting geen geen geen geen meting12

I

100 10' 102 10'1 ' ' " " " ' ' ' " " " ' ' ~

" " " '

10~' hoekïryuenlie Irad~s] Figuur 3.2 Reproduceerbaarheidsmeting 8 en 12

In tabel 3.1 staan nog meer reproduceerbaarheidsmetingen vermeldt. Naar aanleiding van deze bevindingen

zijn alle na nu volgende meetresultaten afkomstig van metingen met een opgelegde rek van 1%.

Tabel 3.2 Resultaten van reproduceerbaarheidsmetingen met intercept in ''log.

3.3 Resultaten dynamische metingen

In deze paragraaf worden de gevonden resultaten van de dynamische metingen weergegeven in tabel- en grafiekvorm. Als eerste volgt een tabel met de gebruikte meetresultaten opgedeeld in categorieën met daarbij de verstreken tijd in dagen tussen het overlijden van de hond en de meting.

meetingnr.

li

intercept specificatie

IIX

ouderdom (dagen) 1 -0.73 ~ 4 . 7 5 -0.72 -0.73

I

I

2 -0.73

metingnummers gemiddelde en st.dev. slope

1, 18, 55 -0.73 f 0.015

5

I

-0.72

gemiddelde en st.dev. intercept 2.79 f 0.34 -0.7 1

7

-0.77 -0.75 8, 25, 36 43, 50 -0.72 f 0.010 -0.76 5 0.014 2.47 t 0.11 2.89 t 0.13

2.82

i

dienopvrnrpn ra- .--A---

i

15

1.97 N, bevroren 4 N, bevroren N, bevroren gekoeld gekoeld 2.36 gekoeld 4 2.80 vers O 2.9% vers 1

Tabel 3.2 Selectie van de gevonden meetresultaten (intercept in '@log).

Om wat meer inzicht te krijgen in het verschil en de spreiding in en tussen de 4 categorieën wordt hieronder

nog een tabel met gemiddelde waarden en bijbehorende standaard deviatie van de slope en de intercept weergegeven.

I

soort proefstuk

/

diepgevroren N, bevroren ~~ 41 '), 46, 57 46, 57 -0.71 f 0.047 -0.74 t 0.014 2.40 f 0.38 2.61 f 0.10

Tabel 3.3 Gemiddelde en standaardafwijking per categorie (intercept in '@log).

i n 4

-

-

E 103:

-

-

hoekfrequentie [radis]

Figuur 3.4 Drie diepgevroren proefstukjes

4 - 0 meting1 1 .+ meting 1 : 60 dagen . meting 55 : 15 dagen - meting 18 : 6 dagen 3 + o + o + o . + O *

.

.

* meii"g18 P"ingj5

i

t

I- i n 2 1 o

t

W e k van mering41 vergeleken mer de metingen 46 57

v

i

. +

+ +meting57

Figuur 3.5 Drie

N,

bevroren proefstukjes

Figuur 3.4 is een grafiek van diepgevroren proefstukjes bij elkaar. De tijd dat de proefstukjes in de diepvries

hebben gelegen is erbij vermeld. Figuur 3.5 is een grafiek van N, bevroren proefstukjes bij elkaar. Nu moet

hier bij worden opgemerkt dat meting 41 is uitgevoerd met een proefstukje dat al beschadigd was geraakt bij

het prepareren en wat nog een keer extra rekken te verduren heeft gehad door een kleine rotatie van de onderplaat als gevolg van condens vorming.

Wanneer de figuren 3.4 en 3.5 ter vergelijking samen in één figuur worden geplaatst, resulteert figuur 3.6.

Verklaring Figuur 3.5 van boven naar beneden :

meting 1 o (diepgevr.) meting 18

+

(diepgevr.) meting 57

+

(N, bevroren)

I

Grafiek van de metingen 1,18,55,41,46 en 57

meting 46

*

(N, bevroren) meting 55

*

(diepgevr.) neiifig 41 o (N, bevïoieiì) ')

hoekfrequentie Irad/sl

Figuur 3.6 De diepgevroren en N, bevroren proef- stukjes samen

Tenslotte worden nog de meetresultaten van de gekoelde en de verse proefstukjes in grafiek vorm

gepresenteerd.

Grafiek van meting8 vergeleken me1 de metingen 25 37

l o 4 1

101

-IO-' 100 10'

Figuur 3.7 Drie gekoelde proefstukjes

en 16 103: lo/ 101 10-1 meting50 O . o . haeldrequentie LradJsl

iguur 3.8 Twee verse metingen

Figuur 3.7 bestaat uit de data van de gekoeld bewaarde proefstukjes en figuur 3.8 is afkomstig van de twee

D i s c m ' e 12

4.

DISCUSSIE

4.1 Algemeen

Condensatie van waterdamp op het nucleus pulposus materiaal speelt geen rol (zie paragraaf 3.1). Voor alle

metingen die gedaan zijn mei een i-ek van i% gelûi ûat een cûntïûk of ïepïûdUceeïbâaïheids irietiiìg

nagenoeg dezelfde waarden oplevert (zie paragraaf 3.2). Deze relatie is niet meer geldig wanneer metingen van verschillende proefstukken worden vergeleken. Dit onderlinge verschil kan worden veroorzaakt doordat het wervelniveau van de wervel waaruit het proefstuk is genomen verschilt, de honden van twee verschil- lende rassen zijn, de leeftijd van de honden variabel is en natuurlijk het uitnemen van het proefstukje. Er kunnen namelijk extra rekken in het materiaal optreden als gevolg van niet goed prepareren, het materiaal kan verder, zonder dat het uiterlijk opgemerkt kan worden, met het scherpe scalpel zijn beschadigd en er

kunnen problemen optreden wanneer het proefstukje op de RFS-I1 moet worden geplaatst.

4.2 Shear-thinning gedrag van de nucleus pulposus

In het vorige hoofdstuk zijn de r e d t a t e n van de dynamische experimenten aan nucleus pulposus proef- stukken gepresenteerd. De dynamische viscositeit vertoont een dalend verloop als functie van de hoek- frequentie (figuren 3.2 t/m 3.8). Geconcentreerde oplossingen vertonen onder afschuiving shear-thinning: een dalende viscositeit bij toenemende afschuifsnelheid (Blom et al., 1988). Een verklaring voor deze daling is de volgende (Van Driel, 1994). Beschouw de nucleus pulposus als een oplossing met daarin een gekluwde hoeveelheid geaggregeerde proteoglycanen en collagene vezels. Onder afschuiving zal de kluwen zich ontrafelen (en eventueel strekken). Op macroscopisch niveau verdwijnen er moleculaire interacties (het afbreken van de aggregaten). Dit verschijnsel heeft een viscositeitverlagend effect: de weerstand tegen afschuiving neemt af. In praktijk betekent dit dat bij een axiale rotatie van de wervelkolom de weerstand tegen deze beweging afneemt indien de snelheid van de beweging toeneemt. Indien de afschuifsnelheid groter is zullen, op macroscopisch niveau, de moleculaire interacties sneller verdwijnen. Het viscositeit- verlagende effect is dan groter.

4.3 Verse en gekoelde metingen

Er zijn twee versmetingen verricht die zijn weergegeven in figuur 4.1.

Deze metingen zijn verricht op nucleus pulposus materiaal van één hond (hond D), maar wel aan een verschillend proefstuk, het prepareren is bij beiden goed verlopen en er hebben zich tijdens de meting geen problemen voorgedaan. Het feit dat de twee metingen niet gelijk zijn kan dan welhaast alleen maar te wijten

zijn aan het verschil van wervelniveau en het verschil in versheid (meting 43: 4 uur na overlijden, meting 50:

figuur 4.2) en liggen alle drie onder de twee verse meetcurves (zie figuur 4.3).

Grafiek van meting43 vergeleken met meting50

I o 4 1

1 t b . I ' ' ' " " " 100 ' ' ' " " " 10' ' ' ' " " ' 102 hoekfrequentie [rads]

Figuur 4.1 De versmetingen

Grafiek van meting8 vergeleken met de metingen 25 37

1

' O d d o . + O f 0. .

. .

+ * O

I

I t i , ' ' " " " ' 1 0 0 ' ' " " " ' 101 ' 10' hoeldrequentie [rad/s] Figuur 4.2 De gekoelde metingen

De 3 metingen met de gekoelde proefstukken zijn van 2 honden (meting 8 van hond A en de metingen 25 en

37 van hond C ) van hetzelfde ras (herder) afkomstig (zie tabel 2.1). Het wervelniveau van meting 8 is niet bekend.

Verklaring Figuur 4.3 boven naar beneden :

meting 50 o (vers) meting 43

*

(vers) meting 25

+

(gekoeld) meting 8 o (gekoeld) meting 37

*

(gekoeld) van

Grafiek van de metingen 50,43,25,8 en 37 1 0 4 - 1 , I I I,,,, O + * o 0 1 O2 10' IO-' 100 10' hoekfrequentie [rads]

Figuur 4.3 De verse en gekoelde metingen samen

Tijd die is verstreken tnssen het overlijden van de hond en de meting, het wervelniveau:

- meting 50 19 uur , L2-L3 - meting 43 4 uur , L3-L4 - meting 25 3 dagen, L5-L6 - meting 8 3 dagen, onbekend - meting 37 4 dagen, L3-LA

Er zijn hier twee tendensen te bespeuren. Enerzijds speelt de ouderdom van het proefstukje een rol door een

uitdrogings effect en anderzijds is het wervelniveau een bepalende factor doordat sommige tussenwervel- schijven door hun functie in de wervelkolom nu eenmaal flexibeler zijn dan andere. Het is dus zeer moeilijk

om aan de hand van deze 5 metingen uitspraken te doen.

Ter vergelijking de meetresultaten van Van Driel tegenover de huidige meetresultaten. Van Drie1 vond bij de

verse metingen een gemiddelde waarde van 0.79 f 0.01 voor de intercept tegen 2.89 t- 0.13 nu. Vergelijking

van de slope geeft -0.69 0.01 tegen -0.76 f 0.014. De gevonden resultaten liggen ver uit elkaar, dit kan

verklaard worden door de prepararatie methode voor verse proefstukjes van Van Driel. De meetwaarden die

4.4 N, Bevroren en diepgevroren metingen - 103: .

-

-a B

-

.E

102

p

:

-

x a 10': 100

Er zijn drie diepgevroren en drie N, bevroren metingen verricht die gebruikt worden, deze zijn weergegeven

in de figuren 4.4 en 4.5. Bij de diepgevroren proefstukjes is te zien dat hoe langer ze in de diepvries hebben gelegen, des te groter de uitdroging is (bij uitdrogen wordt het materiaal nl. visceuzer). Bij de bevroren

priefstfikjes kan dit uitdroglngseffect geen rol spelen e n zullen de viscositeits veranderingen dus volledig

afiankelijk zijn van het bevriezingseffect.

J . + + +meling57 * t . +

3

. + '? *mefuif46 * t o peting41') * +

3

. i . * * + 0 0

I

Grafiek van meungl vergeleken met de metingm 18 55

Grafiek van meting55 vergeleken met meting57

1 0 4 ~ I I rm.m,m8 I meting55

-

2

103:

-

* meting57 IJ IJ > c

'E

102: h : 3 . * < > * : ( > - IO' IO-' 100 10' 102 hoekirequentie [raus]

I

hoekfrequentie [radls]

I

Figuur 4.4 Drie diepgevroren proefstukjes

Grafiek van meting41 vergeleken met de metingen 46 57

I

Een van de diepgevroren proefstukjes (meting 55) is na de gewone meetsessie nog een keer met stikstof

overgoten (dus nog een keer N, bevroren) wat geresulteerd heeft in meting 57 (zie figuur 4.6).

Figuur 4.6 Plaatje-van het extra bevroren proefstukje

In deze figuur is dan te zien dat er aan het bevriezen bepaalde consequenties zijn verbonden. De intercept van de dynamische viscositeits meting daalt van 2.82 naar 2.68, maar de slope (de "helling") blijft ongeveer

gelijk (-0.75 tegen -0.73). Dit betekent dat door het bevriezen de eigenschappen van het materiaal veranderen en een mogelijke verklaring is dat er collageenvezels zijn gebroken. Het breken van de collageenvezels zal leiden tot een viscositeitverlaging omdat ze in principe het nucleus pulposus materiaal verstevigen c.q. bij elkaar houden.

Van Driel vond voor twee diepgevroren proefstukjes (75 en 18 dagen oud) een gemiddelde intercept van

2.65 +. 0.55 tegen 2.79 r 0.34 nu. De waarde van de slope is nagenoeg gelijk (-0.71 t 0.02 vs. -0.73 +.

O.Oí5). Daar de preparatie methode van Van Driel voor de diepgevroren proeÎstukjes goed was en de in dit

rapport geproduceerde resultaten voor de diepgevroren proefstukjes met zijn bevindingen overeen komen, kan er geconcludeerd worden dat de tijdens deze stage ontwikkelde preparatie methode van gelijke kwaliteit is. Omdat Van Driel voor de verse proefstukjes een andere preparatie methode heeft gebruikt (de nucleus pulposus met een lepel uit de anulus fibrosus verwijderen) die resulteerde in onverklaarbare resultaten, kan er geconcludeerd worden dat deze afwijkende resultaten aan de veranderde preparatie methode te wijten zijn en dat de in dit rapport gevonden meetresultaten voor de verse proefstukken wel goed zijn.

meting 57

+

(N, bevroren) meting 46

*

(N, bevroren) meting 41 o (N, bevroren)

4.5 N, Bevroren en diepgevroren versus verse metingen

100 10' 102

100 10-1

hoekfrequentie [rads]

Een figuur van de N, bevroren en de verse proefstukjes laat zien dat de verse metingen boven de andere

metingen liggen (zie figuur 4.7).

Verklaring Figuur 4.7 boven naar beneden :

meting 50 -. (vers) meting 43 -- (vers)

Grafiek van de metingen 41.46 en 57 vergeleken met 43 en 50

r,,,

' ' 7>"'" ' '

"""l

Figuur 4.7 Verse en N, bevroren proefstukjes

Dat de verse meetcurves boven de bevroren liggen is natuurlijk niet verbazingwekkend. Dat is het vermoeden waar de stage op is gebaseerd. Er moeten echter geen overhaaste conclusies worden getrokken voordat er

Verklaring Figuur 4.8 van boven naar beneden :

meting 1 o (diepgevr.) meting 55 -_ (vers) meting 55

+

(diepgevr.) meting 43 -- (vers) meting 18

*

(diepgevr.) meting43 k

1

1 d 1 0 0 10' 102 ' ' ' ' ' " " hoekfrequentie Irad/sl

Figuur 4.8 Verse en diepgevroren proefstukjes

De figuur van de diepgevroren en verse proefstukjes tezamen toont dat de meetresultaten in hetzelfde gebied liggen. Wanneer we nu ook de figuren 4.6 en 4.7 in beschouwing nemen dan is hiervoor een verklaring te geven. Er is hier sprake van twee elkaar "opheffende" effecten. Enerzijds een dynamische viscositeits-

verlaging door beschadiging van de proteoglycanen aggregaten, anderzijds een dynamische viscositeits-

verhoging door het uitdrogingseffect tijdens het bewaren van het materiaal in de diepvries.

Dit is een sterk vermoeden, een eenduidige verklaring is niet mogelijk vanwege het feit dat twee van de drie

N,

bevroren metingen een bepaalde geschiedenis hebben. Zo is het proefstukje van meting 41 mechanisch

beschadigd, meting 57 stamt van een proefstukje wat ooit diepgevroren is geweest, en alleen meting 46 is

afkomstig van een N2 bevroren vers proefstukje.

I

hoekfrequentie [raùls]

I

Figuur 4.9 Vers en N2 bevroren meting aan één proefstukje

Maar dat bovenstaande uitspraken niet ongegrond zijn moge duidelijk worden aan de hand van figuur 4.9 dat

laat zien dat de N, bevroren meting van een vers proefstukje onder de verse curve ligt. Vergelijking van de

Disc- tegen 2.54.

categorie

L

4.6 Evaluatie

afwijking slope afwijking intercept

(procenten) (factor)

-3.9 % 0.79

=

1.26

-6.6 % 0.32

=

3.10

-2.6 % 0.52

=

1.91

-5.3 % 0.38

=

2.63

In paragraaf 3.3 is in tabel 3.3 het gemiddelde met de standaardafwijking voor de slope en de intercept (in

lol- --^-^-+,,.A ^_r ""t,n,in

lug) g e p G ~ G l l L G G 1 ~ yGl baLbguiib. Er wordt :U: ee:: vergelijhg gemaakt met deze geEidde!de wxix!en v i n

elke categorie ten opzichte van de verse proefstukken. Dit betekent dat er per categorie wordt gekeken hoeveel de gemiddelde waarden afwijken van de verse resultaten. Bij de slope wordt dit verschil uitgedrukt in procenten en bij de intercept in een factor tussen de reële waarden (zie tabel 4.1).

Tabel 4.1 Verschillen t.o.v. verse meetresultaten.

De verschillen van de slope zijn klein, terwijl de factorverschillen tussen de verschillende intercepts ook acceptabel zijn. Binnen de groep van de diepgevroren proefstukken bijvoorbeeld, zijn de factorverschillen al groter, tussen meting 1 (60 dagen oud) en meting 15 (15 dagen oud) zit een factor 2.0 verschil in de reële

waarde van de intercept (1318 tegen 665) en een factor 4.8 verschil tussen meting 1 en meting 8 (6 dagen

oud).

Het bewaren van de proefstukken tijdens de stage is, zoals hierboven gesteld, gebeurd door een tussenwervel- schijf omsloten door de beide weïvels in een gesloten plastic zak in de diepvries of koelkast te pjaatsen. Dit is gedaan om uitdroging van de nucleus pulposus ten gevolge van blootstelling aan onnatuurlijke omgevings- omstandigheden te voorkomen.

Een ander aspect wat bij een vervolg onderzoek ook nog getest moet worden is de mogelijkheid om

N,

bij

het bevriezen te vervangen door isopentaan. Isopentaan heeft een kookpunt dat hoger ligt dan de kamertem-

peratuur in tegenstelling tot

N,

en zal dus niet gaan koken (resulteert in gasvorming) bij het opwarmen na

het bevriezingsproces. Gebruik van isopentaan was bij de huidige testopstelling niet mogelijk omdat het moeilijk te verwijderen is uit de bevochtigingskamer na het bevriezingsproces. Isopentaan blijft namelijk in

C o n c l a s k a d a a b e v e h g e a 2 3

5.

CONCLUSIES EN AANBEVELINGEN

5.1 Conclusies

-

_{v e dynamische metingen aan de nucleus püiposüs pïoefsiükken zijn goed üiiuûeïbââï, alleen het goed}

kunnen prepareren levert in het algemeen wel wat problemen op. Het zou daarom gemakkelijker zijn om

voor een vervolg onderzoek andere biologische materialen te gebruiken. Een nadeel hiervan is wel dat een

directe vergelijking van de onderzoeken dan niet meer mogelijk is. Een bijkomend voordeel kan zijn dat het

materiaal wellicht van de RFS-I1 afneembaar is en dan bestaat er dus ook de mogelijkheid om verse

proefstukjes in de diepvries te doen en het lange termijn effect te testen.

De diepgevroren en de verse nucleus pulpûsus proefstukjes verschillen weinig, intercept 2.79 k 0.34 tegen

2.89 f 0.13 (factor 0.79 in reële waarden) en de slope -0.73 0.015 tegen -0.76 k 0.014. De N, bevroren

en de verse proefstukjes daarentegen verschillen meer, intercept 2.61 +I 0.10 (zonder meting 41) tegen 2.89 k

0.13 (factor 0.52 in reële waarden) en de slope -0.71 k 0.047 tegen -0.76

*

0.014. Deze ogenschijnlijk

tegenstrijdige resultaten worden waarschijnlijk veroorzaakt door de twee elkaar tegenwerkende effecten van uitdroging van de gehydrateerde proteoglycanen naarmate de tijd verstrijkt dat het proefstuk in de diepvries ligt en beschadiging van de collageen vezels door de mechanische belasting die ontstaat bij het invriezen.

5.2 Aanbevelingen

ook het effect testen van de duur die een proefstukje in de diepvries ligt,

t meer verse proefstukken meten, en deze ook met N, bevriezen,

t als verbetering van de N, bevriezingsmethode gebruïi maken van het bij kamertemperatuur vloeibiare

Referenties 24

REFERENTIES

Blom, C., Jongschaap, R.J.J, Mellema, J., Inleiding in de reologie, Technische Universiteit Twente, Kluwer

Technische boeken, 1988.

Driel, W. van, Viscoelastische eigenschappen van de tussenwervelschijf, WFW-rapport 94.053, Technische