Nederlandse samenvatting voor de leek
Baarmoederhalskanker
Baarmoederhalskanker wordt jaarlijks wereldwijd bij ongeveer 470.000 vrouwen geconstateerd, ongeveer de helft van hen overlijdt aan de ziekte.
Baarmoederhalskanker wordt veroorzaakt door het humaan papillomavirus (HPV). Er zijn meer dan 100 types HPV bekend en sommige van deze virussen worden hoogrisico types HPV genoemd. Deze virussen kunnen een gewone cel transformeren tot een kankercel. Twee van de eiwitten van het HPV, E6 en E7, zijn verantwoordelijk voor deze transformatie van gewone cel tot kankercel. E6 en E7 kunnen het systeem van de cel dat bepaalt of de cel zal gaan delen verstoren. Door deze verstoring krijgt de cel niet meer het signaal om te stoppen met delen als dat nodig is. Hierdoor zal dus ongecontroleerde celgroei kunnen ontstaan met als gevolg kanker.
Het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift gaat over de ontwikkeling van een ‘therapeutisch’ vaccin tegen baarmoederhalskanker. Een therapeutisch vaccin is een vaccin dat gebruikt wordt om een ziekte te behandelen. Naast therapeutische vaccins bestaan er ook ‘profylactische’ vaccins; dat zijn vaccins die een infectie voorkomen. Voorbeelden hiervan zijn de vaccinaties die we als kind krijgen om infecties met een aantal virussen en bacteriën te voorkomen, zoals de polio, bof, mazelen, rode hond, difterie, kinkhoest en tetanus vaccinaties. Voor HPV wordt ook gewerkt aan een profylactisch vaccin. De eerste resultaten van onderzoek op dit gebied zien er veelbelovend uit.
Cellen en virussen: afmetingen
Het menselijke lichaam bestaat uit ongeveer 1013 cellen, dat is dus 1 miljoen maal 1 miljoen maal 10.000 cellen. Cellen zijn de bouwstenen van het lichaam en er zijn ongeveer 200 verschillende types cellen in ons lichaam. Deze cellen vormen samen onder andere organen, bloedvaten, botten en spieren.
Een menselijke cel bestaat uit vele verschillende onderdelen. In de kern van de cel zit het genetische materiaal, het DNA. Op dit DNA ligt alle informatie die de cel nodig heeft om normaal te kunnen functioneren. DNA wordt vertaald in RNA en vervolgens wordt het RNA weer vertaald naar eiwitten. De kern van de cel zit in het cytoplasma van de cel. Het cytoplasma is een soort soep van verschillende ingrediënten. De vloeistof van de soep heet cytosol en de andere ingrediënten zijn allerlei celonderdelen zoals mitochondriën (energiefabriekjes) en het Golgi apparaat (dit bouwt de eiwitten die in de cel gemaakt worden af). Het cytoplasma wordt omringd door het membraan van de cel, dit is een dubbele laag van vetten (lipiden) met daarin allerlei eiwitten die naar binnen en naar buiten steken.
Een menselijke cel is gemiddeld 10 micrometer groot, dat is dus 0,01 millimeter.
Virussen zijn veel kleiner dan een menselijke cel, namelijk gemiddeld ongeveer 0,1 micrometer. Een virus is dus honderd keer zo klein als een menselijke cel. De afmetingen van een menselijke cel en van een virus zijn moeilijk te bevatten voor ons omdat we beiden niet met het blote oog kunnen waarnemen. Om deze getallen in perspectief te plaatsen is het daarom makkelijker om het virus in gedachten te
daarom het afleveren van het genetische materiaal van het virus in het binnenste van de cel (het cytosol) zodat dat genetische materiaal door de gastheercel kan worden afgelezen en vermenigvuldigd.
Het afleveren van het virale genetische materiaal is niet eenvoudig omdat de cel goed beschermd is door zijn membraan. Na de binding van eiwitten in het membraan van het virus aan eiwitten die in het membraan van de gastheercel zitten (de receptor) kan het virus zijn genetisch materiaal op twee manieren de cel binnenbrengen.
In de eerste plaats kan het membraan van het virus versmelten met die van de gastheer. Zo komt het genetische materiaal van het virus terecht in het cytosol van de gastheercel. Een voorbeeld van een virus dat dit doet is het HIV dat AIDS kan veroorzaken.
De tweede manier waarop een virus zijn genetische materiaal de cel in kan brengen begint met “receptor-gemedieerde endocytose” (Figuur 2, stap 2 en 3). Hierbij wordt het virus als het ware ingesloten door het celmembraan en komt in een soort ballonnetje in de gastheercel. Dit ballonnetje heet een endosoom. Het geheel wordt opgenomen in de cel. Het virale genetische materiaal wordt dan door twee membranen, dat van het virus zelf en dat van het endosoom, gescheiden van het cytosol.
De volgende stap die het virus moet nemen is ontsnappen uit het endosoom.
Zodra het endosoom in het cytoplasma van de cel zit wordt de zuurgraad in dit ballonnetje verlaagd en daardoor verandert het eiwit in het membraan van het virus. De verandering van dit eiwit zorgt ervoor dat het membraan van het virus kan versmelten met het membraan van het ballonnetje. Hierdoor komt de inhoud van het virusdeeltje (het genetische materiaal) vrij in het binnenste van de cel (het cytosol) (Figuur 2 stap 4). Daar zal het genetische materiaal zich kunnen vermenigvuldigen en het genetische materiaal zal ook worden afgelezen en vertaald naar capside-eiwitten en naar virale membraaneiwitten.
Er moeten van deze drie nieuw gemaakte ingrediënten nu nog nieuwe virusdeeltjes worden gevormd. De nieuwe virusdeeltjes moeten vervolgens ook nog uit de gastheercel ontsnappen. Het nieuw gemaakte genetische materiaal vormt eerst samen met de capside-eiwitten van het virus nieuwe nucleocapsiden. De nucleocapsiden worden naar het membraan van de cel getransporteerd. Op het membraan van de cel bevinden zich de nieuwe membraaneiwitten van het virus (het derde ingrediënt) op dat moment ook al. De nucleocapsiden duwen zichzelf vervolgens naar buiten door het membraan heen en nemen zo een stuk van het celmembraan, met daarop de nieuwe virale membraaneiwitten, mee. Hierdoor kunnen uit een gastheercel vele nieuwe virusdeeltjes voortkomen. Deze virusdeeltjes kunnen weer een nieuwe gastheercellen infecteren waardoor een virusinfectie zich in korte tijd kan verspreiden binnen een gastheer.
De twee virussen die naast HPV in dit proefschrift voorkomen, Semliki Forest virus en influenza virus, gebruiken deze “receptor-gemedieerde endocytose” om de gastheercel binnen te komen.
Figuur 2. Membraanvirussen en hun interactie met een gastheercel. Stap 1 is binding van het virus aan een receptor op het membraan van de gastheercel. De tweede en derde stap laten “receptor-gemedieerde endocytose” zien, de opname van het virus door afsnoering van een ballonnetje van het membraan van de cel. In stap 4 ontsnapt de inhoud van het virus uit het ballonnetje doordat eiwit op het membraan van het virus samensmelting van het virusmembraan met het membraan van het ballonnetje bewerkstelligt. In stap 5 zit het genetische materiaal van het virus los in het cytosol van de cel waar het vervolgens in stap 6-8 kan zorgen voor de vorming van nieuwe virusdeeltjes.
Het immuunsysteem
Het immuunsysteem beschermt ons tegen allerlei vreemde indringers van buiten, zoals bacteriën en virussen. Het beschermt ons ook tegen vreemde elementen binnen in ons lichaam, zoals kankercellen. Zonder ons immuunsysteem zouden we weerloos zijn tegenover infecties en kanker. Het immuunsysteem bestaat uit een groot aantal verschillende cellen en andere elementen, zoals antistoffen. Het gaat te ver om het hele immuunsysteem uit te leggen in dit hoofdstuk. Bovendien is er nog een heleboel onbekend over ons immuunsysteem. Omdat dit proefschrift gaat over kankercellen en virussen zal ik me beperken tot de reactie van het immuunsysteem op deze twee elementen.
Zodra er iets vreemds binnenkomt in ons lichaam, wordt dat opgenomen door antigeen-presenterende cellen (APCs). Een antigeen is een substantie die een immuunrespons kan opwekken, bijvoorbeeld een stukje van een virus. Antigeen-presenterende cellen heten zo omdat ze na opname van het virus dit virus kunnen verwerken en vervolgens stukjes van het virus kunnen presenteren aan andere cellen van het immuunsysteem.
Die andere cellen waaraan de stukjes virus worden gepresenteerd heten T lymfocyten. Er bestaat een aantal varianten van. Een van die soorten T lymfocyten is de cytotoxische T lymfocyt (CTL). Cyto betekent cel en toxisch betekent giftig. Deze CTL kan cellen doden met een aantal giftige stoffen die hij bij zich draagt. Gelukkig maakt een CTL niet willekeurig cellen in ons lichaam dood, maar alleen die cellen
waarvoor hij een opdracht heeft gekregen. Het verkrijgen van die opdracht is ook weer aan strakke regels gebonden zodat er eigenlijk bijna nooit iets fout gaat met deze gevaarlijke cellen. CTLs zijn als het ware de geheimagenten van ons lichaam en ze krijgen hun opdrachten van de antigeen-presenterende cellen.
Die antigeen-presenterende cellen kunnen alleen een opdracht geven als ze zelf goed geactiveerd zijn door het antigeen én als ze een stukje van het antigeen presenteren aan een juiste CTL, een CTL die dat specifieke stukje kan herkennen. Als dat het geval is krijgt de CTL toestemming om alle cellen in het lichaam die dat stukje antigeen ook op hun oppervlak hebben te doden.
Bij een virusinfectie is het antigeen een stukje van het virus dat gepresenteerd wordt op het oppervlak van cellen die geïnfecteerd zijn met het virus. Bij kankercellen ligt het wat ingewikkelder. Kankercellen waren eerst gewone cellen van ons lichaam die normaal gesproken niet herkend en aangevallen zouden moeten worden door het immuunsysteem. Dat maakt het ontstaan van een kankergezwel ook mogelijk, kankercellen zijn als het ware onzichtbaar voor het immuunsysteem. Toch zijn er vaak wel veranderingen opgetreden in een kankercel die herkenning door het immuunsysteem mogelijk maken. Een probleem is de juiste activatie van de antigeen-presenterende cel, die is in het geval van kanker vaak niet gebeurd.
Bij baarmoederhalskanker zijn beide situaties die hierboven beschreven zijn van toepassing. Baarmoederhalskanker wordt veroorzaakt door het HPV virus. Twee van de eiwitten van HPV, E6 en E7, zijn nodig voor het veranderen van een gewone cel in een kankercel. Die eiwitten zijn dus altijd aanwezig in de baarmoederhalskankercellen.
Stukjes van E6 en E7 worden dus ook gepresenteerd op het oppervlak van baarmoederhalskankercellen. Alleen is het immuunsysteem van een patiënte met baarmoederhalskanker niet op de juiste manier geactiveerd zodat de kankercellen niet worden herkend en gedood.
Gebruik maken van de eigenschappen van virussen om de immuunrespons te sturen
Het doel van het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift is het afleveren van de eiwitten E6 en E7 aan antigeen-presenterende cellen op zo’n manier dat ze worden geactiveerd en deze eiwitten aan CTL presenteren. De CTL krijgen op die manier toestemming om alle baarmoederhalskankercellen, die stukjes van deze eiwitten op hun oppervlak presenteren, te doden. De CTLs moeten dus leren om E6 en E7 te herkennen.
Omdat alle baarmoederhalskankercellen de eiwitten E6 en E7 nodig hebben om kankercel te blijven, zullen al deze cellen ook stukjes van deze eiwitten op hun oppervlak hebben. Als we CTLs in het lichaam van een kankerpatiënte zover kunnen krijgen dat ze deze eiwitten herkennen en cellen die de eiwitten op hun oppervlak presenteren doden, dan hebben we dus een specifieke therapie ontwikkeld tegen baarmoederhalskanker.
In dit proefschrift worden twee manieren beschreven om het immuunsysteem te leren kankercellen te herkennen: in de eerste benadering wordt gebruik gemaakt van
vergroten tot een bol met een doorsnede van 1 meter. Dan zou een menselijke cel zo groot zijn als de Martinitoren. Een mens zou dan zo groot zijn als anderhalf keer de doorsnede van de aarde.
Virussen
Een virus is geen levend wezen, het kan namelijk niet zelfstandig functioneren.
Virussen kunnen zichzelf niet voortbewegen, ze kunnen niet eten en, bovenal, ze kunnen zichzelf niet vermenigvuldigen zonder gebruik te maken van cellen van een ander organisme. Toch veroorzaken virussen veel ernstige ziektes zoals griep, AIDS, hepatitis, ebola, mazelen en herpes.
Een virus heeft dus de cellen van een mens of dier of bacterie nodig om zichzelf te vermenigvuldigen. En het enige dat een virus wil bereiken is zichzelf vermenigvuldigen.
De structuur van een virus is dan ook veel simpeler dan de structuur van een menselijke cel. Een virus bestaat uit genetisch materiaal (DNA of RNA moleculen) omringd door eiwitten die een beschermende laag rond het genetische materiaal vormen. Deze eiwitten heten capside eiwitten en samen met het genetische materiaal heet dit het nucleocapside van een virus.
Sommige virussen bestaan alleen uit deze componenten. Het HPV, dat baarmoederhalskanker veroorzaakt, is een voorbeeld van zo’n virus (zie Figuur 1, links). Bij andere virussen wordt het nucleocapside omringd door een envelop of membraan, bestaande uit vetten (lipiden) en eiwitten. Virussen met een envelop heten membraanvirussen. Influenza virus en Semliki Forest virus zijn voorbeelden van membraanvirussen (zie Figuur 1, midden en rechts).
Figuur 1. Voorbeelden van virussen. Cryo-elektronenmicroscopie reconstructiefoto’s van humaan papillomavirus (HPV, links), Semliki Forest virus (midden, met dank aan Dr. S. Mukhopadhyay, Purdue Univerisity) en een electronenmicroscopiefoto van A/Panama influenza virus (rechts).
Infectie van een gastheercel door een membraanvirus
De eerste stap in het proces van infectie van een gastheer is de binding van het virus aan een gastheercel. De eiwitten in de envelop van het virus steken naar buiten en deze eiwitten kunnen binden aan de cellen van de gastheer (Figuur 2, stap 1).
Het virus kan zelf zijn genetische materiaal niet aflezen en vermeerderen, het heeft daarvoor de machinerie van de gastheercel nodig. De tweede stap in de infectie is
het zogenaamde Semliki Forest virus expressie systeem, in de tweede benadering wordt gebruik gemaakt van influenza virosomen.
Semliki Forest virus
Semliki Forest virus (SFV) is, zoals hierboven al is aangegeven, een membraanvirus.
SFV behoort tot de familie van de alfavirussen. Het genetische materiaal van SFV is RNA en dit kan in het cytosol van de cel direct worden afgelezen tot eiwit. Van het SFV is een “expressiesysteem” ontwikkeld. Dit systeem verschilt op twee belangrijke punten met het oorspronkelijke SFV:
1) de virusdeeltjes zijn maar eenmalig infectieus en kunnen geen nieuwe infectieuze virusdeeltjes voortbrengen; hierdoor is het een zeer veilig systeem;
2) in het genetische materiaal van het virus kan ander genetisch materiaal, in ons geval bijvoorbeeld van E6 en E7, worden ingebracht. Dit wordt net zo vaak vermenigvuldigd als het genetische materiaal van het virus tijdens de eenmalige infectie en in de gastheercel worden dus ook heel veel van die eiwitten gemaakt.
Als een cel geïnfecteerd wordt met SFV gaat hij altijd na enkele dagen op een speciale manier dood. Dit proces heet apoptose en tijdens dit proces komen er kleine blaasjes van de cel vrij. Deze blaasjes zitten vol met E6 en E7, omdat de hele geïnfecteerde cel vol zat met deze eiwitten. Hiermee hebben we een systeem ontwikkeld waarmee we in cellen van het lichaam heel veel van deze eiwitten kunnen maken. Dit SFV waarin we het genetische materiaal voor HPV E6 en E7 geplaatst hebben noemen we SFVE6E7. Omdat dit SFV maar eenmalig infectieus is zullen de, potentieel gevaarlijke, eiwitten E6 en E7 niet permanent aanwezig zijn in gevaccineerde individuen.
Met dit SFVE6E7 virus hebben we muizen gevaccineerd (Hoofdstuk 2). Enige tijd na de vaccinatie hebben we gekeken of T cellen van deze muizen kankercellen die E6 en E7 stukjes op hun oppervlak hebben kunnen doden. Dat zou namelijk betekenen dat, dankzij de vaccinatie met SFVE6E7, de T cellen geleerd hebben om deze eiwitstukjes te herkennen en dat de vaccinatie dus specifieke CTLs heeft opgeleverd.
De T cellen van de gevaccineerde muizen konden inderdaad buiten de muizen kankercellen met stukjes E6 en E7 op hun oppervlak herkennen en doden.
De volgende test was of vaccinatie van muizen met SFVE6E7 ook in de muizen zelf genoeg CTLs opwekt om kankergroei te voorkomen. Om dit te testen werden muizen gevaccineerd met SFVE6E7 en een aantal weken later ingespoten met kankercellen die stukjes E6 en E7 op hun oppervlak presenteren. De vaccinatie kon bij 40% van de muizen uitgroei van een tumor voorkomen!
Vaccinatie met SFVE6E7 lijkt dus een veelbelovende methode te zijn maar nog niet goed genoeg. In jaren volgend op dit onderzoek is in onze groep gewerkt aan het verbeteren van deze vaccinatiemethode met het SFV systeem. Er is een nieuw soort SFVE6E7 gemaakt dat ervoor zorgt dat er nog veel meer van E6 en E7 wordt geproduceerd in de geïnfecteerde cellen en dat ervoor zorgt dat E6 en E7 veel stabieler zijn in de cel. Met dit nieuwe SFV systeem kunnen nog betere resultaten worden behaald. Zelfs muizen die al een tumor hebben kunnen door vaccinatie met dit nieuwe
SFV systeem worden genezen! Dit maakt SFVE6E7 een zeer veelbelovende strategie voor toekomstige therapeutische vaccinatie bij baarmoederhalskanker.
Onderzoek naar het mechanisme achter succesvolle vaccinatie met SFV
Omdat we erg graag wilden weten waarom het SFV systeem zo effectief is hebben we geprobeerd het mechanisme achter de opwekking van CTLs door SFV te achterhalen (Hoofdstuk 3).
De simpelste manier waarop een antigeen-presenterende cel (APC) de stukjes eiwit binnen kan krijgen om deze stukjes vervolgens te presenteren aan de CTL is doordat de APC zelf zou worden geïnfecteerd. Als eerste hebben we daarom gekeken of SFV direct (APC) kan infecteren. Na uitvoerig onderzoek met verschillende APCs van muizen en mensen waarmee onder veel verschillende omstandigheden infecties met SFV werden uitgevoerd bleek dat SFV niet direct APCs kan infecteren.
De andere mogelijkheid van opwekking van CTLs door SFV is infectie van andere celtypes dan APCs met SFV, waarna de geproduceerde E6 en E7 eiwitten of stukjes daarvan op de een of andere manier in APCs terechtkomen. We wisten al dat SFV na infectie van een cel zorgt voor celdood (apoptose) van die cel, waarna die gastheercel blaasjes loslaat met daarin het geproduceerde eiwit. De hypothese was dan ook dat APCs misschien deze blaasjes zouden kunnen opnemen en zo het geproduceerde E6 en E7 eiwit ook opnemen. Als dit eiwit zich eenmaal in de APCs bevindt kunnen deze cellen het verwerken en stukjes ervan presenteren op hun oppervlak aan CTLs.
Om deze hypothese te testen werd een aantal verschillende SFVs gemaakt die het genetische materiaal van een modeleiwit bevatten (om precies te zijn een van de eiwitten van influenza virus, het nucleoproteïne (NP)). Deze verschillende SFVs verschilden in de hoeveelheid NP die werd geproduceerd na infectie van een cel en in de stabiliteit van het NP. Als de hypothese zou kloppen dat APCs stukjes van met SFV geïnfecteerde en daarna afgestorven cellen opnemen dan zou dát SFV dat zorgt voor productie van het meeste en meest stabiele NP na vaccinatie ook de hoogste CTL respons moeten geven. Dit was inderdaad het geval. Dit resultaat gecombineerd met het feit dat SFV APCs niet direct kan infecteren is een zeer sterke aanwijzing voor de volgende hypothese met betrekking tot het mechanisme achter het succes van SFV vaccinatie: SFV infecteert cellen en in de geïnfecteerde cellen wordt veel van het gecodeerde eiwit geproduceerd. De geïnfecteerde cellen gaan vervolgens dood en laten blaasjes los met daarin het geproduceerde eiwit. Deze blaasjes worden op hun beurt weer opgenomen door APCs en de stukjes van de eiwitten uit de blaasjes worden gepresenteerd aan CTLs. Door de opname van blaasjes van door apoptose gestorven geïnfecteerde cellen worden APCs goed geactiveerd. Het uiteindelijke resultaat is een juiste instructie van de CTLs.
Influenza virosomen
Influenza virus is een virus dat bijna iedereen wel kent; het is namelijk het virus dat griep veroorzaakt. Dit virus dringt, net als SFV, cellen binnen via
Influenza virus is een virus dat bijna iedereen wel kent; het is namelijk het virus dat griep veroorzaakt. Dit virus dringt, net als SFV, cellen binnen via