Het overmatig gebruik van natuurlijke hulpbronnen en de grootschalige synthese van xenobiotische verbindingen hebben geleid tot verscheidene milieuproblemen. De schadelijke effecten van organische en anorganische stoffen op ecosystemen en de volksgezondheid zijn welbekend. Verontreiniging van lucht, water en bodem hebben schadelijke effecten op de verschillende biota, en verstoren biogeochemische kringlopen. Er is veel geld en energie gestoken in het beperken en reinigen van industriële afvalstromen. Steeds meer aandacht wordt besteed aan het concept van duurzame ontwikkeling door middel van biologische reinigingsmethoden.

Biologische reinigingsmethoden zijn steeds belangrijker geworden bij het verwijderen van giftige stoffen uit het milieu en de afvalstromen. Deze technieken worden al jaren toegepast, bijvoorbeeld voor het zuiveren van grond- en afvalwater. De basis van deze processen wordt gevormd door de activiteiten van micro-organismen die de organische verbindingen afbreken. Microorganismen zijn in staat om een breed scala van organische verbindingen te mineraliseren, zowel van natuurlijke als chemische oorsprong.

Door hun unieke eigenschappen zijn gefluoreerde koolwaterstoffen van essentieel belang voor zowel de synthese van bioactieve farmaceutische en agrochemische verbindingen als voor de productie van stoffen met elektronische toepassingen. De door de mens veroorzaakte introductie van gefluoreerde koolwaterstoffen in het milieu vormt een gevaar voor de aanwezige ecosystemen. Tijdens de laatste 40 jaar werd echter duidelijk dat sommige microben over enzymsystemen beschikken die in staat zijn deze milieuverontreinigende stoffen af te breken. Het begrip van deze mechanismen kan helpen om een kostenefficiënte manier te vinden voor het verwijderen van deze vervuilingen uit het milieu.

Het werk in dit proefschrift beschrijft de afbraak van gefluoreerde verbindingen door bacteriële stammen, de identificatie van genen die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de katabole cascades, de identificatie en zuivering van enkele belangrijke enzymen en afbraakroutes van de geselecteerde fluoraromaten.

Hoofdstuk 2 beschrijft de afbraak van de 4-fluorkaneelzuur (4-FCA). De bacterie Arthrobacter sp. stam G1 is onder aerobe omstandigheden in staat 4-FCA om te zetten in 4-fluorobenzoëzuur (4-FBA) door het afsplitsen van twee koolstofatomen. Naast een kleine hoeveelheid 4-fluoroacetofenon was 4-FBA het belangrijkste eindproduct. Om het afbraakmechanisme van 4-FCA te bestuderen werd cel-vrij extract (CVE) gebruikt van, met 4-FCA geïnduceerde cellen van stam G1. De eerste stap bij de omzetting van de 4-FCA is koppeling aan coenzyme A. Dit werd waargenomen wanneer 4-FCA werd geïncubeerd in aanwezigheid van ATP, MgSO4, coenzym A en CVE. Deze stap is vergelijkbaar met de

eerste stappen in katabolisme van kaneelzuur, coumarinezuur en ferulazuur. Na het toevoegen van NAD+ aan het reactiemengsel, werden twee producten gevormd, namelijk 4-fluorfenyl-β-hydroxy-propionyl-CoA and 4-fluoro-β-ketopropionyl-CoA. Dit suggereert dat de 4-FCA-oxidatie route verloopt via additie van water. De omzetting van het CoA-adduct in zijn hydroxy-derivaat door hydratase bleek niet mogelijk, tenzij NAD+ aan het reactiemengsel werd toegevoegd. In principe is bij hydratatie een cofactor geen vereiste, maar blijkbaar stimuleert NAD+ de hydratase activiteit en verdere omzetting. Dit kan veroorzaakt worden door een multifunctioneel eiwitcomplex. Soortgelijke eiwitcomplexen zijn karakteristiek voor β-oxidatie systemen in microorganismen, voor zowel de tweede als de derde reactiestap in de cyclus. Voor een volledige afbraakroute van 4-FCA moet ook het gevormde 4-FBA afgebroken worden. Om dit te bereiken hebben we Ralstonia sp. stam H1 geïsoleerd. De stam H1 kan 4-FBA als enige koolstofbron gebruiken waarbij fluoride vrijkomt.

In hoofdstuk 3 wordt de afbraakkinetiek van 4-FCA met behulp van de zuivere en gemengde culturen verder onderzocht. In batch cultuur brak Arthrobacter sp. G1 stam 2 mM 4-FCA volledig af en groeide op deze stop. Ralstonia sp. H1 stam was in staat 4-FBA snel af te breken met een vergelijkbare groeisnelheid. In een mengcultuur van de stammen G1 en H1 werd de hoogste afbraaksnelheid waargenomen bij een concentratie van 3 mM 4-FCA. De mengcultuur heeft tevens een hoger tolerantieniveau voor 4-FCA dan een zuivere cultuur van G1. Om verdere groei- en afbraakkinetiek te doorgronden, werden de kinetische gegevens geanalyseerd met behulp van de kinetische modellen van Monod, Haldane-Andrew en Luong-Levenspiel. Volgens het Luong-Levenspiel-model is de, onder aerobe omstandigheden, maximaal toelaatbare 4-FCA concentratie voor de gemengde batchcultuur 44 mM. In een onder steady-state condities groeiende mengcultuur met continue aanvoer van 10 mM 4-FCA werden bij plotselinge toediening van een pickbelasting van 4-FCA deze extra 4-FCA volledig afgebroken zonder negatief effect op de groeisnelheid. Deze resultaten suggereren dat deze stammen van groot nut kunnen zijn voor de industriële afvalwaterzuivering.

In hoofdstuk 4 wordt de identificatie van twee genen-clusters, betrokken bij de afbraak van 4-fluorfenol (4-FP), beschreven en wordt tevens een afbraakroute voorgesteld.

Deze genen-clusters zijn aanwezig in Arthrobacter sp. FP1 stam die twee exemplaren van het 4-fluorfenol-monooxygenase (FpdA1 en FpdA2) en een flavine reductase (FpdB) bezit. De sequentie van de twee monooxygenases is voor 98,9% gelijk op aminozuursequentie niveau

(6 verschillen). De beide genen werden in E. coli BL21(DE3) tot expressie gebracht, gezuiverd en gebruikt voor de eerste stap van bestudering van de 4-FP afbraakroute. FpdA2 in oplossing is kleurloos en heeft geen absorptie in de regio van 320-500 nm, wat suggereert dat FpdA2 zelf geen flavine cofactor bevat. FpdA2 behoort tot de klasse D van monooxygenases en gebruikt verlaagd FAD als een coenzym, dat wordt gegenereerd door een flavine reductase.

Degradatie van 4-FP begint met omzetting naar benzoquinon en het vrijkomen van fluoride. Benzoquinon werd omgevormd tot hydroquinon door NADH-oxidatie. Hydroquinon werd vervolgens langzaam omgezet door een mengsel van FpdA2 en FpdB waarbij hydroxyhydroquinon gevormd werd. Het FpdC dioxygenase produceert maleylacetaat, dat waarschijnlijk in β-ketoadipaat wordt omgezet door het FpdD maleylacetaat reductase.

In hoofdstuk 5 wordt de afbraakroute van 2-fluorfenol (2-FP) bestudeerd. Cellen van de stam Rhodococcus sp. stam FP1 bleken in staat 2-FP af te breken. Naast de vrijgekomen fluoride werd er geen ophoping van een andere verbinding waargenomen. Door 2-FP geïnduceerde eiwitten werden met behulp van tweedimensionale (2-D) gelelektroforese gedetecteerd en met massa-spectrometrie geïdentificeerd. Van de geïdentificeerde eiwitten warener vier direct betrokken bij de afbraak van 2-FP.

Er werden twee verschillende monooxygenases (vergelijkbaar met fenol-2-monooxygenase van Rhodococcus sp. RHA1) en een vermeend fenol-hydroxylase (vergelijkbaar met een hydroxylase uit Rhodococcus opacus B4). De DNA-sequenties van deze eiwitten vertonen een grote overeenkomst (92%), waaruit blijkt dat er twee verschillende genen zijn die coderen voor de monooxygenases. Daarnaast werd een triplet van spots met dezelfde moleculaire massa (30 kDa) waargenomen en geïdentificeerd als catechol-1,2-dioxygenase.

Zuivering van fenol-monooxygenase en catechol-1,2-dioxygenase met kolomchromatografie maakte het mogelijk om de eerste twee stappen van 2-FP afbraakroute te bestuderen. Gezuiverd fenol-monooxygenase heeft een reductase nodig voor de afbraak van 2-FP. Hiervoor hebben we FpdB, beschreven in hoofdstuk 4, toegevoegd. Fenol-monooxygenase behoort tot klasse D van de flavine-afhankelijke Fenol-monooxygenases waarvan de flavine-reductase FAD reduceert tot FADH2, dat vervolgens door de monooxygenase wordt gebruikt om 2-FP af te breken. Omzetting van ortho-gesubstitueerde fenolen kan op twee manieren; namelijk hydroxylering met en zonder het vrijkomen van het anion. In dit geval kwam geen fluoride vrij en het enige product was 3-fluorocatechol (3-FC). Gezuiverd catechol-1,2-dioxygenase werd gebruikt om 3-FC om te zetten en de producten zijn

geïdentificeerd met 19F NMR. Muconaat-cycloisomerase, tevens geïdentificeerd door middel

van 2-D gel elektroforese en MS-analyse, zette eerst 2-fluoromuconaat om in 5-fluoromucono-lacton en vervolgens in cis-dienelacton met vrijgave van fluoride.

In hoofdstuk 6 wordt een nieuw Baeyer-Villiger-monooxygenase beschreven en wordt het substraat-bereik van deze BVMO onderzocht. De meeste van de beschreven Baeyer-Villiger-monooxygenases zijn Type I BVMO’s. Deze BVMO’s zijn covalent gebonden aan FAD en hebben NADPH nodig als een elektron-donor. Onder aerobe omstandigheden genereert het BVMO een reactief intermediair door het vormen van een covalente binding tussen moleculaire zuurstof en de C4a van het flavine. Afhankelijk van de protonering ondergaat deze intermediair hetzij nucleofiele hetzij elektrofiele oxygenatie. Bij het ontbreken van een substraat, vervalt de intermediair tot de geoxideerde flavine, hetgeen leidt tot waterstofperoxide (H2O2) als product.

Het beschreven BVMO werd geïsoleerd uit een cultuur van Gordonia sp. stam SH2 die was opgehoopt met α,α,α-trifluoroacetofenon (TFAP) als het belangrijkste substraat. Het enzym accepteert een brede verscheidenheid aan substraten. Naast alifatische en cyclische verbindingen worden ook aromatische substraten geaccepteerd. Oxygenatie van deze verbindingen door BVMO-activiteit resulteerde in de vorming van de overeenkomstige lactonen en esters. De BVMO was tevens enantioselectief bij sulfoxidatie van methyl-fenyl-sulfide, ethyl-fenyl-methyl-fenyl-sulfide, benzyl-methyl-sulfide en methyl-p-tolyl-sulfide. Volledige

conversie van alle vier sulfiden resulteerde in de vorming van (S)-enantiomeren met ee ≥ 97%. Een soortgelijke enantioselectiviteit voor deze sulfiden werd waargenomen bij

HAPMO.

Fenylaceton-monooxygenase (PAMO), cylopentanon-monooxygenase (CPMO) en cyclohexanon-monooxygenase (CHMO) zijn bestudeerd vanwege hun hoge enantio- en regioselectiviteit voor verschillende substraten. De unieke kenmerken van PAMO tussen deze BVMO’s zijn de thermostabiliteit en tolerantie voor hoge concentraties van organische oplosmiddelen. PAMO heeft bijvoorbeeld een halfwaardetijd van 1 dag bij 52°C, terwijl andere BVMO’s minder stabiel zijn.

Studies met verschillende substraten suggereren dat BVMO’s een breed scala aan stoffen kan omzetten met vaak overlappende specificiteit. Zo worden aromatische sulfiden en bicyclohexanon omgezet door verschillende BVMO’s. Het is bekend dat CHMO van Acinetobacter sp. NCIMB 9871 meer dan 100 verschillende substraten kan omzetten en voor PAMO uit Thermobifida fusca zijn 35 verschillende sulfiden als substraat beschreven. De

BVMO uit Gordonia sp. SH2 stam bleek belangrijke oxidatieve reacties te katalyseren die niet gemakkelijk met chemische middelen zijn uit te voeren. Deze eigenschappen maakt dat oxidatieve enzymen niet alleen worden gebruikt voor zuivering van verontreinigde locaties, maar ook voor de synthese van belangrijke chemicaliën.

Vooruitblik

De in deze studie geïsoleerde en gebruikte bacteriestammen vertonen eigenschappen die van grote waarde kunnen zijn voor de afbraak van milieuverontreinigende gefluoreerde verbindingen. Mono-culturen van deze bacteriën zijn zeer nuttig voor het begrijpen van de afbraakroutes voor deze verbindingen en maken het mogelijk om bioreactoren voor de verwijdering van deze toxische verbindingen te ontwikkelen. Industrieel afval bevat vaak mengsels van toxische stoffen die mogelijkheden voor bacteriële degradatie beperken. Voor sanering van vervuilde sites en afvalwater zijn mengcultures van bijvoorbeeld Arthrobacter sp. stam G1 en Ralstonia sp. H1 stam een betere keuze dan monoculturen.

Fluorfenolen zijn belangrijke milieuverontreinigende verbindingen. Direct verwijderen van fluor is een aantrekkelijke route voor het metabolisme van fluoraromaten.

De 4-fluorfenol-monooxygenases beschreven in dit proefschrift zijn de eerste voorbeelden van dergelijke enzymen die inwerken op fluorfenolen.

In de loop van dit onderzoek hebben we geprobeerd om een breder scala van microbiële stammen te isoleren om de afbraak van trifluormethyl bevattende verbindingen te onderzoeken. Hiervoor hebben we bodemmonsters verzameld van locaties die verontreinigd zijn met insecticiden, herbiciden en andere xenobiotische organohalogenen. Een mengsel van deze monsters was gedurende een langere periode geïncubeerd in mineraal medium met trifluoracetaat (TFA), trifluorethanol (TFE), trifluortolueen (TFT) en trifluoracetofenon (TFAP). Na een incubatietijd van twee jaar hebben we Gordonia sp. stam SH2 geïsoleerd.

Deze stam breekt TFAP. Er kwam echter geen fluor vrij doordat TFAP werd omgezet tot fenol en trifluoroacetaat (TFA). Deze laatste verbinding hoopte in het medium op als doodlopende metaboliet.

Het lot van trifluor-verbindingen is dus nog steeds onduidelijk. In het milieu is het meest gevormde product waarschijnlijk TFA. We hebben nog geen bacteriecultuur uit bodemmengsels kunnen isoleren die TFA gebruikt als koolstofbron, hetgeen suggereert dat TFA onder aerobe omstandigheden op grote schaal recalcitrant is tegen biologische afbraak.

Tot nu toe loopt dit experiment bijna 3 jaar, maar we konden geen zuivere of gemengde

cultuur isoleren die kan groeien op trifluor-verbindingen. Blijkbaar zijn deze verbindingen zeer weerbarstig.

Samengevat liggen er grote uitdagingen voor milieu-microbiologen door de synthese en uitstoot van duizenden nieuwe chemische verbindingen. Biologische afbraak ervan is de belangrijkste factor die het gedrag in het milieu bepaalt.

ACKNOWLEDGEMENTS

I am thankful to Almighty Allah, most Gracious, who in His infinite mercy has guided me to complete this PhD work. May Peace and Blessings of Allah be upon His Prophet Muhammad (peace be upon him). I am highly indebted to my parents, Ejaz and Hameeda and my brothers, Arif and Zia for their continuous support that made every opportunity available to me throughout my life.

I am thankful to my promotor Professor Dr. Dick B. Janssen who gave me the opportunity to work under his supervision in his research group with some of the most talented people I have ever met. The experience I have had with Professor Janssen over the past four and half years cannot be summed up in a hackneyed phrase or saying, but I would like to express my gratitude and appreciate him for guiding me during the course of my research work with his unique style of “gradually increasing the level of criticism” and the most valuable lesson of “writing not too complex” and “feeling responsibility”. He urged me to work in his group in the Socratic Method by constantly thinking and asking questions to myself and to those who knew the answers at every step of my practical and writing work, which helped me to always think creatively and rationally.

I would like to thank the members of the reading committee, Professor Dr. B.

Poolman, Professor Dr. J.D. van Elsas, and Professor Dr. L. Dijkhuizen for reviewing and evaluating my thesis.

For day-to-day lab support I thank Piet Wietzes for his very calm and “its possible”

attitude, and Theodora Tiemersma in keeping all analytical instruments in perfect running condition. I would like to thank Jaap Kingma for helping me with 4-fluorophenol monooxygenase purification and Peter Jekel for discussions about enzyme kinetics. I would like to thank Sandra and Karlien for their assistance in administrative work during my stay here and specially submission of thesis and all other documentations.

I would like to thank our collaborators in Porto, Portugal, Professor Dr. Paula M.

Castro and Anouk Duke for the isolation and characterization of Rhodococcus sp. strain FP1 and a wonderful reception for our meeting held in December 13-14, 2009 in Porto. I wish them good luck for their research work studying degradation kinetics of toxic fluorinated environmental pollutants and identification of degradation pathways.

I am really going to miss the other members of my research group, Prof. Dr. Marco W. Fraaije (group leader), Dr. Gerrit J. Poelarends (genius), Dr. Erik van Hellemond

laughing style), Dr. Anett Kirschner (future professor), Dr. Wiktor Szymanski (bioChemist), Dr. Edwin van Bloois (protein expert), Ghania Hasnaoui-Dijoux (quiet) Jianfang Jin (my best friend of Janssen group), Chiara Tarabiono (soft spoken), Martijn Koetsier (art lover), Roga Kembaren (enthusiastic), Ciprian Crismaru (brand conscious), Marcus Schallmey (my research brother), Wu Bian (scientist+sportsman), Ite Teune (encyclopedia), Alja Westerbeek (caring), Christiaan Postema (innovative), Remko Winter (good presenter), Hanna Dudek (PAMO-mutants expert), Anette Riebel (everyone’s friend), Ana Toplak (thinker and dreamer), Gocia Kopacz (friendly) and our new colleagues, Dr. Hein Wijma (bioArchitect), Matthew Heberling (focused), Robert Floor (cooperative), Hugo van Beek (scientist), Maarten Groenveld (confident) and Dr. Gonzalo de Gonzalo (BVMO-friend) for their cooperation and valuable suggestions.

My special thanks to Ravi Marreddy for guiding me with two-dimensional gel electrophoresis and Jan van Leeuwen for accompanying me to travel by bike in July 2007 to different geographical sites in The Netherlands. These sites were contaminated with herbicides, pesticides and other recalcitrants and situated 30-40 km away from our laboratory.

We collected soil samples for the isolation of bacterial strains capable to degrade fluorinated compounds. I would also like to thank Dr. Hjalmar P. Permentier, who guided me with analyzing and identifying proteins from 2-D gels, Dr. Daniel E. Torrez Pazmiño for infinite discussions on various topics including BVMOs and Christiaan Postema for the translation of English summary to Dutch.

I am also thankful to my Pakistani colleagues (HEC Scholars) of the Janssen group, Muhammad I. Arif and Ghufrana Samin for useful discussions and wish them good luck for their PhD studies.

I would like to acknowledge the financial support of HEC (Higher Education Commission), Government of Pakistan under HEC-NUFFIC overseas scholarship program and thank to all those people who have been involved in taking care of me during my PhD studies in Groningen, The Netherlands.

Syed Adnan Hasan 2010

In document University of Groningen Biodegradation of fluorinated environmental pollutants under aerobic conditions Hasan, Syed Adnan (Page 106-115)