N EDERLANDSE SAMENVATTING

Mensen slapen ongeveer acht uur per dag, dit – alles bij elkaar opgeteld – is een derde van ons leven. Dit feit alleen al is genoeg om te beseffen dat slaap een essentiële fysiologische rol speelt.

Omdat we ’s ochtends in de regel opgefrist en uitgerust opstaan, wordt slaap intuïtief als een herstelproces gezien. Desondanks is de precieze functie van slaap nog steeds onbekend. Wat de reden voor slaap ook moge zijn, wij moeten regelmatig slapen om een goede lichamelijke en geestelijke prestatie te leveren. Een aantal humane studies heeft uitgewezen dat een paar uur slaap minder dan de gemiddelde 8 uur per etmaal over een langere periode leidt tot ernstige verstoringen in hersenenfuncties zoals emotie, cognitie, motorische- en leerprocessen. Omdat grote aantallen mensen in de moderne samenleving aan chronisch slaaptekort lijden heeft dit dus verstrekkende gevolgen voor de gezondheid en voor de economie. In de laatste honderd jaren hebben we onze tijd in bed met 20% gereduceerd. Dit betekent dat we nu gemiddeld genomen een of twee uur korter slapen dan mensen die honderd jaar geleden leefden. De reden voor slaaptekort zijn meestal de verslavende afleiding geboden door televisie, het enorme aanbod van informatie door media en internet, ploegendienst en de werkdruk veroorzaakt door de zogenoemde 24/7 maatschappij die door modernisering en globalisering zijn ontstaan.

De vraag is natuurlijk of dit chronische slaapgebrek op de lange termijn tot gevolgen voor de menselijke gezondheid kan leiden. Epidemiologische onderzoeken hebben uitgewezen dat er een verband bestaat tussen slaapstoornissen en psychologische problemen en dat verstoorde slaap kan bijdragen aan het ontstaan van stemmingstoornissen. In een van deze onderzoeken werden medische studenten gevraagd over hun leef- en slaapgewoonten. De gevraagde populatie werd verder gevolgd en 30 tot 40 jaren later werden ze nogmaals ondervraagd, maar dit keer over hun gemoeds-toestand. Alhoewel de proefpersonen aan het begin van de studie allemaal gezond leken, bleek dat de individuen met meer slaapproblemen later in het leven een sterk verhoogde kans hadden op depressie. Andere studies suggereren dat slaapstoornissen niet alleen een risicofactor zijn voor depressie maar ook voor andere emotionele aandoeningen bijv. voor het posttraumatische stress syndroom.

Het hoofddoel van dit proefschrift was om een verband te leggen tussen twee onderzoeksgebieden. Aan de ene kant het onderzoek dat heeft uitgewezen dat slaapstoornissen ernstige gevolgen kunnen hebben voor de gemoedstoestand van het individu. Aan de andere kant het onderzoek dat bezig houdt met het ontrafelen van de neurobiologische achtergrond van de stemmingsziekten zoals depressie, manie, en posttraumatisch stress syndroom. Gebaseerd op dit uitgangspunt, was de belangrijkste vraag van dit proefschrift of chronische slaaptekort zal leiden tot neurobiologische en fysiologische veranderingen, die ook typisch zijn voor stemmingsziekten.

Om slaaptekort op te wekken in ons experimentele diermodel hebben we ratten in langzaam ronddraaiende trommels geplaatst. De rotatiesnelheid van de trommels was net groot genoeg om de dieren wakker te houden, maar niet zo snel dat de dieren een te zware lichamelijke inspanning moesten leveren. Om chronisch en gedeeltelijk slaaptekort na te bootsen werden ratten

ratten 4 uur per dag in hun thuiskooi uitrusten. Naast de slaapgedepriveerde dieren hebben we twee controlegroepen gebruikt. De ratten van de ene controlegroep verbleven in hun thuiskooi tijdens de gehele experiment. De ratten van de tweede controlegroep werden in trommels geplaatst die twee keer zo snel draaiden maar dan gedurende de helft van de tijd. Op deze manier moesten deze controle ratten dezelfde afstand afleggen in de rotatiewielen als de slaapgedepriveerde ratten maar konden aan hun fysiologische slaapbehoefte van een rat voldoen (dit is ongeveer 10 tot 12 uur per dag).

Het tweede hoofdstuk van dit proefschrift gaat over de effecten van chronisch slaapgebrek op het serotonine-1A receptor systeem. In mensen die aan depressie lijden, is de gevoeligheid van dit receptor systeem vermindert en als gevolg hiervan is vermoedelijk ook de signaaloverdracht door serotonine verminderd. Volgens een veel aangehangen theorie over de ontwikkeling van depressie is het deze gereduceerde serotonerge neurotransmissie die uiteindelijk leidt tot een verstoorde stemming. Tijdens ons onderzoek aan slaaprestrictie bij ratten onderzochten we de gevoeligheid van het serotonine-1A receptor systeem aan de hand van het fysiologische verschijnsel dat het inspuiten van de 1A receptor agonist 8-OH-DPAT een karakteristieke acute daling van de lichaamstemperatuur veroorzaakt. Uit de sterkte van deze temperatuurdaling kunnen we conclusies trekken over de algemene gevoeligheid van het receptor systeem. In ons onderzoek werd de lichaamstemperatuur met een radio-telemetrie systeem gemeten. Hiertoe werd een temperatuurgevoelig zendertje in de buikholte van de ratten geϊmplanteerd dat radiosignalen over de lichaamstemperatuur stuurt naar onder de kooien geplaatste ontvangers. Vervolgens stuurden deze ontvangers hun digitale signalen naar een computer. Onze resultaten hebben laten zien, dat chronisch slaaptekort in ratten geleidelijk aan de gevoeligheid van serotonine-1A receptoren vermindert. Deze zg. desensitisatie van de serotonine receptoren treedt nog niet op na één of twee dagen slaaprestrictie, maar wordt heel significant na 8 dagen slaapgebrek. Experimenten met controledieren tonen aan, dat deze desensitisatie niet een gevolg is van het voortdurend lopen in de rotatietrommels, maar echt het gevolg is van slaapgebrek. In een vervolg experiment toonden we aan dat de verminderde serotonine receptor gevoeligheid niet snel normaliseerde. Na 8 dagen slaaprestrictie was er een vrijwel even lange periode met normale slaap nodig om de receptor gevoeligheid weer te herstellen.

Het derde hoofdstuk vat een aantal experimenten samen die waren ontworpen om vast te stellen of de desensitisatie van de serotonine receptoren het gevolg is van gebrek aan slaap of van verhoogde spiegels van stresshormonen. De aandacht ging hierbij met name uit naar de glucocorticoid hormonen die worden geproduceerd door de bijnieren en welke een verklaring zouden kunnen zijn veer de serotonine receptor desensitizatie. Om deze reden werden de effecten van slaaprestrictie in intacte ratten vergeleken met de effecten in ratten waaruit de bijnieren operatief waren verwijderd. De tweede vraag in dit hoofdstuk was of slaaprestrictie niet alleen van invloed is op de gevoeligheid van serotonine receptoren maar ook invloed heeft op een ander neurotransmitter systeem: de muscariene acetylcholine receptor. De reden hiervoor was dat eerder onderzoek heeft uitgewezen dat dit transmitter systeem gevoeliger is in het geval van depressie en dat een verstoring van het evenwicht tussen het serotonine en het acetylcholine systeem wellicht

de neurobiologische basis vormt van depressie. De gevoeligheid van het acetylcholine systeem werd op dezelfde wijze gemeten als voor het serotonerge systeem. De muscariene receptor werd geactiveerd met de agonist oxotremorine waarna de daling van de lichaamstemperatuur werd gemeten. De resultaten van deze experimenten bevestigden onze eerdere waargenomen desensitisatie van het serotonerge systeem, maar tevens vonden we dat deze desensitisatie onafhankelijk is van het stresshormoon corticosteron. Daarentegen werd de gevoeligheid van de muscariene receptor verhoogd in de controlegroep waarvan de dieren wel genoeg konden slapen maar die sneller moesten lopen en verhoogde stresshormoon niveaus hadden. Dit is een belangrijke conclusie omdat naast slaaptekort ook stress wordt gezien als een risicofactor voor depressie. Verder komen slaapgebrek en stress vaak samen voor in onze maatschappij en zouden op deze wijze mogelijk gezamelijk kunnen leiden tot een serotonerge/cholinerge disbalans en een hersenenconditie die de ontvankelijkheid voor het ontstaan van depressie bevordert.

Stresshormonen lijken niet verantwoordelijk te zijn voor de slaaprestrictie-geinduceerde desensitisatie van het serotonine 1A receptor systeem, maar omgekeerd zouden slaaprestrictie en desensitisatie van serotonine-receptoren wel kunnen leiden tot een verandering in de regulatie van stresshormonen. In hoofdstuk vier onderzochtten we het effect van chronische slaaprestrictie op een van de belangrijkste stress systeem van het lichaam, de zg. hypotalamus-hypofyse-bijnier as (hypothalamus-pituitary-adrenal axis, HPA). Dit HPA systeem produceert de stresshormonen adrenocorticotroop hormoon (ACTH) en corticosteron, wanneer het individu zich in stressvolle situaties bevindt. Eerdere experimenten hebben laten zien, dat de ACTH afgifte na een stressor vermindert door slaaprestrictie, maar dat de corticosteron afgifte onveranderd blijft. Omdat de afgifte van ACTH in belangrijke mate wordt gereguleerd door corticotropin releasing hormoon (CRH) en serotonine, hebben wij in dit hoofdstuk de ACTH en corticosteron afgifte gemeten na het inspuiten van CRH en de al eerder genoemde serotonine-1A agonist 8-OH-DPAT. In dit experiment werden ratten met een canula in de vena jugularis gebruikt, waardoor bloedmonsters stressvrij konden worden afgenomen. Deze experimenten lieten zien dat chronisch slaaptekort de ACTH afgifte opgewekt door CRH en 8-OH-DPAT vermindert. Dit betekent waarschijnlijk dat slaapdeprivatie de gevoeligheid van CRH en serotonine-1A receptoren in de hypofyse reduceert.

Tegelijkertijd bleek de corticosteron afgifte door CRH en 8-OH-DPAT in de slaapgedepriveerde dieren onveranderd. Dit zou het gevolg kunnen zijn van een verhoogde gevoeligheid van de ACTH receptoren in de bijnieren. Op deze manier kan een verminderde hoeveelheid ACTH tot dezelfde corticosteron afgifte leiden.

In het vijfde hoofdstuk werden de celbiologische veranderingen onderzocht die de verminderde en door serotonine-1A receptor bepaalde fysiologische responsen veroorzaken.

Hiertoe hebben we hersenenmateriaal betrokken uit dieren na chronische slaaprestrictie en controle dieren. Vervolgens hebben we met autoradiografische technieken de hoeveelheid van serotonine-1A receptoren gemeten en ook de daaran gekoppelde G-eiwittten (deze eiwitten zijn de eerste boodschappers die receptorveranderingen opvangen aan de buitenzijde van de cel, doorgeven aan de binnenkant van de cel). In de door ons onderzochtte hersengebieden bleek

maakt aannemelijk dat de waargenomen fysiologische veranderingen na slaaprestrictie niet door stoornissen in de receptoren worden veroorzaakt, maar zeer waarschijnlijk door andere onderdelen van de signaaltransductie paden. Wat wij vonden na 8 dagen chronisch slaaptekort was een verhoging van de hoeveelheid G-eiwitten, welke opvallend genoeg beperkt was tot een limbisch hersengebied: de amygdala. Dit kan mogelijk betekenen dat in de processen die optreden na slaaprestrictie de amygdala een relatief grote rol speelt. Dit lijkt een belangwekkende conclusie omdat de amygdala een sleutelfunctie vervult in verwerking van emotionele processen in de hersenen.

In hoofdstuk zes beschreven wij de effecten van slaapgebrek op amygdala-afhankelijk en stress-geinduceerd gedrag. We waren geïnteresseerd in de vraag of de biochemische veranderingen in de amygdala, die in hoofdstuk 5 waren beschreven, worden vergezeld door gedragsmatige veranderingen. Om dit te onderzoeken hebben we een zogenoemde ’fear conditioning’ leertaak gebruikt. In deze leertaak wordt de rat in een speciale kooi geplaats voorzien van een vloerconstructie waarmee kleine electrische schokjes werden gegeven. Een dag later, in dezelfde kooi maar dit keer zonder schokken, hebben we gemeten hoeveel tijd het dier bewegingloos heeft doorgebracht. Dit bewegingsloze gedrag is de natuurlijke angstreactie op een omgeving die het dier met schrikwekkende prikkels associeërt. In ons experiment lieten de slaapgedrepiveerde ratten minder bewegingloos gedrag zien in vergelijking met de controle dieren.

Dit zou kunnen duiden op een verminderde emotionele reaktie of op een verstoord associatief geheugen. Het immunocytochemische onderzoek van de hersenen liet verder zien dat de expressie van een neuronale activatie marker (c-Fos) niet veranderd was in de amygdala van dieren met slaaptekort. Dit in tegenstelling tot gebieden in de hippocampus waar meer c-Fos positieve cellen werden gemeten dan in de controle dieren.

Met de experimenten die in het zevende hoofdstuk zijn samengevat hebben we geprobeerd vast te stellen of de door slaapdeprivatie veroorzaakte desensitisatie van het serotonine-1A receptor systeem het gevolg kan zijn van verhoogde adenosine afgifte tijdens het waken. De theoretische achtergrond voor deze veronderstelling waren recente bevindingen dat tijdens waken en slaapdeprivatie de adenosine spiegels in sommige hersengebieden toenemen.

Volgens een gangbare hypothese is adenosine het molecuul dat de slaapbehoefte signaleert.

Naast de wetenschappelijke feiten wordt dit ook bevestigd door onze gewoonte om koffie te drinken ten einde wakker en allert te blijven: caffeϊne is een natuurlijke antagonist van de adenosine receptoren. Verder is het bekend dat de verschillende receptor systemen betrokken bij slaap en slaapgebrek gebruik maken van dezelfde signaaltransductie paden. Bijvoorbeeld de serotonine-1A en de adenosine A1 receptoren worden aan dezelfde G-eiwitten gekoppeld. In het experiment van hoofdstuk 7 hebben we dieren gedurende enkele dagen met een adenosine receptor agonist (cyclohexyladenosine) behandeld, waardoor de adenosine receptoren kunstmatig werden geactiveerd. Deze chronische receptor activatie veroorzaakte een desensitisatie van het adenosine receptor systeem, wat goed te volgen was in de respons op de lichaamstemperatuur en ook in de afname van het aantal adenosine receptoren. Het was interessant om te zien dat de hoeveelheid G-eiwitten toenam in een hersenengebied: de somatosensorische cortex. Echter, de

kenmerkende daling van de lichaamstemperatuur na een injectie met de serotonine-1A agonist 8-OH-DPAT veranderde niet door de chronische adenosinerge behandeling. Uit deze resultaten hebben we geconcludeerd dat chronisch toegenomen adenosine spiegels geen gevolgen hebben voor de verandering in de gevoeligheid van het serotonine-1A receptor systeem. Een afname van de gevoeligheid van het 1A receptor systeem komt waarschijnlijk door de toegenomen serotonine concentraties wat ook een kenmerk is van het wakker-zijn.

Het laatste experimentele hoofdstuk, hoofdstuk acht, behandelt de effecten van slaaptekort op het ontstaan van nieuwe zenuwcellen (neurogenese) in de hippocampus. De hippocampus is het hersengebied dat essentieël is voor leer- en geheugenprocessen en een aantal publicaties van de afgelopen jarene suggereren dat er een verband is tussen hippocampale neurogenese en leervermogen. Verder is het bekend dat te weinig slaap gepaard gaat aan een verminderde leer- en geheugencapaciteit. Onze vraag in dit hoofdstuk was of slaaprestrictie invloed heeft op neurogenese. Onze resultaten lieten zien dat slaaptekort een vermindering veroorzaakt in het aantal celdelingen in de hippocampus. Echter, dit trad al op na een enkele dag slaapdeprivatie. Chronische, gedeeltelijke slaapdeprivatie had geen significant effect op het lot van de nieuwe cellen, namelijk of deze nieuw gevormde cellen zich verder ontwikkelen tot zenuwcel, gliacel of een ander celtype. De afname van celdelingen in de hippocampus wordt beperkt tot de hilus van de gyrus dentatus. Omdat dit deel van de hippocampus meestal gliacellen en geen neuronen produceert, nemen wij aan dat slaapdeprivatie waarschijnlijk slechts de proliferatie en niet de differentiatie van gliacellen beperkt. Dit kan natuurlijk gevolgen hebben op functies van glia zoals de productie van groeifactoren of de opname van glutamaat uit het extracellulaire milieu.

Conclusie. De resultaten van dit proefschrift laten zien dat te weinig slaap die er toe leiden dat het brein veranderingen ondergaat waardoor het individu gevoeliger zou kunnen worden voor emotionele en cognitieve stoornissen. De desensitisatie van het serotonine-1A systeem, de veranderde regulatie van stress systemen, en de verminderde hersenenplasticiteit bevestigen deze veronderstelling. Deze resultaten zullen hopelijk bijdragen aan het besef dat chronisch slaaptekort kan leiden tot verstoringen van hersenprocessen die ten grondslag liggen aan ontwikkeling van depressie en afname van leer- en geheugenprestaties.