E. coli K pneumoniae
4 Discussie en conclusies Aanleiding
In een eerder onderzoek naar het voorkomen van resistente bacteriën in afvalwater werden CPE in inkomend en gezuiverd afvalwater van
afvalwaterzuiveringsinstallaties aangetroffen. Er kon echter niet met zekerheid worden vastgesteld of de CPE voor een groot deel van ziekenhuizen afkomstig waren of niet. Daarom werd hier specifiek de bijdrage van ziekenhuisafvalwater aan het voorkomen van CPE in
gemeentelijk afvalwater onderzocht. Dit is relevant omdat zuivering van afvalwater van ziekenhuizen een effectieve methode kunnen zijn om de emissies van BRMO naar het oppervlaktewater te reduceren.
Totale bijdrage van ziekenhuizen aan resistentie in afvalwater
Om de totale bijdrage van ziekenhuizen aan het voorkomen van
resistente bacteriën in gemeentelijk afvalwater te berekenen, werd het totale aantal CPE dat per dag met het ziekenhuisafvalwater naar de RWZI stroomt (“vrachten”) vergeleken met de binnenkomende vrachten in het RWZI. Naast ziekenhuisafvalwater draagt gemeentelijk afvalwater bij aan de concentratie CPE bij de RWZI. De vrachten konden voor 4 ziekenhuizen worden berekend, omdat voor deze ziekenhuizen het totale volume afvalwater op de dag van de meting bekend was. Voor de
andere ziekenhuizen was het volume afvalwater niet precies bekend (deze ziekenhuizen voerden namelijk geen debietsproportionele monstername uit, zoals tijdens het onderzoek duidelijk werd).
De totale bijdrage van ziekenhuizen aan de vrachten van niet-resistente
E. coli was laag (gemiddeld 0,5%) en toonde weinig variatie (0,04% tot
2%). Dit is in lijn met de verwachting dat er in ziekenhuispatienten niet meer E. coli aangetroffen worden dan bij de bevolking, en met het beperkte aandeel van ziekenhuizen aan het totale gemeentelijke afvalwater (in de hier onderzochte RWZI’s gemiddeld 0,9%). De bijdrage van ziekenhuizen in vrachten CPE varieerden duidelijk sterker dan de bijdrage aan E.coli vrachten en ESBL-E. coli vrachten en hingen af van CPE type, het ziekenhuis en het tijdstip van de meting. De vermoedelijke oorzaak is dat kleine verschillen in het aantal dragers die op afvalwater lozen bij een lage totale aantal dragers tot grotere
verschillen tussen de metingen leiden. De bijdrage van ziekenhuizen aan de totale vracht van CPE lag in 4 van de 17 metingen duidelijk hoger dan voor E. coli, namelijk tussen 10 tot 20%. In het merendeel van de gevallen (13/17) was de bijdrage van ziekenhuizen <10%. Ook indien de CPE genotypen gescheiden worden onderzocht, was de bijdrage van de ziekenhuizen in de meeste metingen <10%. Voor enkele CPE
genotypen kon de bijdrage van ziekenhuizen echter in een enkele meting oplopen tot 63%. In conclusie zijn ziekenhuizen wel een puntbron van CPE en dragen meer CPE bij dan uit de
afvalwatervolumina aan te nemen. Aan de andere kant is het merendeel van alle CPE afkomstig van bronnen buiten het ziekenhuis.
De uit ziekenhuizen afkomstige vrachten aan resistentiegenen en de geschatte vrachten van antibiotica toonden een vergelijkbaar beeld; de bijdrage van ziekenhuisafvalwater was voor veel stoffen en voor de
resistentiegenen beperkt tot enkele procenten, maar kon voor enkele stoffen (trimethoprim, ciprofloxacin) oplopen tot naar schatting >20%. Dit komt overeen met gegevens van Roorda et al. (2009), die voor trimethoprim en ciprofloxacin aan hand van metingen in afvalwater een bijdrage van >20% van ziekenhuizen bepaald hebben. Ook aanhand van gebruiksdata van antibiotica in ziekenhuizen en de algemene bevolking was ciprofloxacin in deze studie voor meer dan 20% van de onderzochte ziekenhuizen afkomstig.
Behandeling van ziekenhuisafvalwater ter reductie van de totale AMR emissies
Indien een groot aandeel van de resistente bacteriën afkomstig zijn uit afvalwater van zorginstellingen, zou een lokale behandeling van dit afvalwater een mogelijkheid zijn om de emissies van deze bacteriën, maar ook van geneesmiddelen en resistentiegenen te reduceren. Deze studie toont dat de onderzochte ziekenhuizen in het merendeel van de metingen minder dan 10% bijdragen aan de totale vracht van CPE, en dat alleen in enkele gevallen en voor enkele genen hogere bijdragen van ziekenhuisafvalwater worden gevonden. Zuivering van
ziekenhuisafvalwater leidt daarom niet tot een substantiële reductie van de totale vracht van CPE. Dit komt overeen met onderzoek naar
emissies van antibiotica uit ziekenhuizen, waarin de bijdrage van
zuivering van ziekenhuisafvalwater aan de reductie van de gehele vracht laag werd ingeschat (Roorda et al. 2009).
In dit project werd geen onderzoek verricht naar de kosten van aanvullende zuivering van ziekenhuisafvalwater voor de reductie van resistente bacteriën. Roorda et al. (2009) constateerden dat
maatregelen ter zuivering van geneesmiddelen in ziekenhuisafvalwater, indien gemeten per kg verwijderd geneesmiddel en niet per vracht, kosteneffectief kunnen zijn. Dit geldt vermoedelijk ook voor CPE en wordt met name door de afvalwaterbehandelingskosten veroorzaakt, die bij behandeling van het relatief lage volume ziekenhuisafvalwater lager zijn dan bij behandeling van het gehele gemeentelijke afvalwater. Zoals boven besproken kan afvalwaterzuivering de totale vracht van CPE echter niet substantieel verlagen.
Prevalentie en concentraties van CPE ziekenhuisafvalwater
In dit onderzoek werden CPE vaker aangetroffen in RWZI influent (26/26 metingen) dan in ziekenhuisafvalwater (18/29 metingen, 6/8
ziekenhuizen). De gemiddelde concentraties CPE varieerden sterk per ziekenhuis en lagen in de monsters waarin CPE werden aangetroffen iets hoger dan in RWZI influent. In CPE-positieve monsters van
ziekenhuisafvalwater droeg gemiddeld ongeveer 1 op de 2000 E. coli bacteriën een carbapenemase gen. Dit was significant hoger dan in gemeentelijk afvalwater, waar gemiddeld ongeveer 1 CPE per 10 000 E.
coli aangetroffen werd. In ziekenhuisafvalmonsters waren er in
vergelijking met gemeentelijk afvalwater ook 2,3 keer zoveel ESBL- producerende E. coli per E. coli. Indien aangenomen wordt dat elke persoon ongeveer evenveel niet-resistente E. coli uitscheidt, zouden in ziekenhuizen gemiddeld meer CPE-dragers en ESBL-dragers voorkomen, of zouden de dragers in ziekenhuizen gemiddeld hogere aantallen
Samengenomen laat dit zien dat ziekenhuizen CPE emitteren, en relatief tot de totale aantal fecale bacteriën ook een hogere CPE concentratie tonen dan RWZI influent. Relatief tot het volume water zijn de
concentraties CPE maar licht verhoogd ten opzichte van RWZI influent.
Concentraties van resistentiegenen en antibioticaresiduen in ziekenhuisafvalwater
Naast CPE werden ook residuen van antibiotica en resistentiegenen in ziekenhuisafvalwater aangetroffen. De concentraties van antibiotica en resistentiegenen waren voor enkele antibiotica (sulfamethoxazole, trimethoprim, ciprofloxacin) en het sulfonamide resistentiegen sul1 in ziekenhuisafvalwater hoger dan in RWZI influent. Dit goldt echter niet voor alle antibiotica en genen.
Bronnen van CPE buiten ziekenhuisafvalwater
Een aantal waarnemingen maken het aannemelijk dat ziekenhuizen niet de enige bron van CPE in gemeentelijk afvalwater zijn. Ten eerste worden CPE in gemeentelijk afvalwater vaker gevonden dan in
ziekenhuisafvalwater. Ten tweede zijn naar vergelijking van de vrachten minder dan 50% van de totale CPE afkomstig uit ziekenhuisafvalwater. Ten derde worden in gemeentelijk afvalwater ook CPE genotypen gevonden die niet in ziekenhuisafvalwater gevonden werden (zie beneden).
Mogelijke andere bronnen van CPE in het gemeentelijke rioolwater zijn huishoudens of andere typen van zorginstellingen, zoals verpleeghuizen. CPE dragers in huishoudens kunnen personen zijn die in een ziekenhuis opgenomen zijn geweest en nu thuis zijn, of personen die gereisd hebben naar landen waar CPE vaker voorkomen dan in Nederland (van Hattem et al. 2016), of kunnen gezinsleden zijn van mensen die CPE opgelopen hebben in het ziekenhuis of buitenland (Haverkate et al. 2017). Maar ook de aanwezigheid van andere dan de onderzochte ziekenhuizen zouden een bijdrage hebben kunnen leveren aan de CPE die bij RWZIs werden aangetroffen. In drie van de onderzochte gebieden (E, D en F) was er sprake van meerdere ziekenhuizen binnen hetzelfde riooldistrict (in locatie D zijn beide ziekenhuizen onderzocht).
CPE varianten
De CPE isolaten uit deze studie zijn gekarakteriseerd voor wat betreft de bacteriesoort en type carbapenemase-gen. Een deel van de gepaarde monsters toont overeenstemming tussen ziekenhuisafvalwater en RWIZ influent: dan wordt een bepaalde CPE variant zowel in het
ziekenhuisafvalwater alsook in het RWZI influent gevonden. In een aanzienlijk deel van de gepaarde ziekenhuis- en RWZI monsters werden bepaalde CPE varianten echter wel in RWZI influent maar niet in de ziekenhuismonsters gevonden. Andersom worden varianten die in ziekenhuisafvalwater worden aangetroffen niet altijd in RWZI influent gevonden. Dit ondersteunt de conclusie gebaseerd op prevalentie en vrachten dat ziekenhuizen bronnen van CPE zijn, en dat er naast ziekenhuizen additionele CPE bronnen bestaan.
De discrepanties in CPE varianten tussen ziekenhuisafvalwater en gemeentelijk afvalwater kunnen – naast echte verschillen tussen deze twee - ook nog een andere verklaring hebben. Vooral bij lage
toeval een grote rol voor de gevonden varianten. Daarnaast is er sprake van een verblijftijd in het riool: het ziekenhuisafvalwater dat in het riool terecht komt heeft tijd nodig om bij de RWZI terecht te komen. Hoe lang dat duurt is afhankelijk van de afstand, het type riool, en de weersomstandigheden, en is niet eenvoudig vast te stellen. Omdat de monsters bij de RWZIs en ziekenhuizen op dezelfde dag genomen zijn wil dat zeggen dat een deel van de RWZI monsters water bevatten dat een dag eerder uit het ziekenhuis gekomen is. Het is daarom in theorie mogelijk dat CPE variant in het rioolwater afkomstig is van een
ziekenhuispatient, maar dat deze op de dag van ziekenhuisafvalwater- monstername niet naar de wc is geweest, of zelfs uit het ziekenhuis ontslagen. Bij de ziekenhuizen waar in plaats van een 24uur
mengmonster een steekmonster is genomen (B en F) zouden de
discrepanties tussen ziekenhuis en RWZI afvalwater nog groter kunnen zijn: “de” CPE drager moet dan toevallig vlak voor de monstername naar het toilet gegaan zijn. De resultaten wijzen er echter niet op dat er meer discrepanties in CPE varianten werden gevonden waar de ziekenhuizen bemonsterd zijn met steekmonsters. Zowel toeval als het effect van verblijftijd kunnen ook verklaren dat in sommige gevallen CPE typen wel in het ziekenhuisafvalwater maar niet in de ontvangende RWZI werden aangetroffen.
De CPE varianten uit deze studie zijn gekarakteriseerd voor wat betreft de bacteriesoort en type carbapenemase-gen. Een verdere
karakterisatie zal nog moeten uitwijzen of twee stammen die identiek lijken ook daadwerkelijk dezelfde zijn. Voorlopige analyses wijzen uit dat dit niet altijd het geval is, maar dat er – zowel tussen als binnen
monsters – meerdere varianten zijn van bacteriën van dezelfde soort met eenzelfde CPE-gen. Aanvullende analyses binnen het kader van een door Interreg gefinancierd onderzoek (EurHealth-1 health) zullen deze vraag nader onderzoeken.
Conclusie
Het huidige onderzoek toont aan dat ziekenhuisafvalwater CPE,
antibioticaresistentiegenen en residuen van antibiotica kan bevatten. In ziekenhuisafvalwater werden in vergelijking met RWZI influent (licht) verhoogde concentraties van CPE en van enkele antibiotica en
resistentiegenen aangetroffen. De bijdrage van ziekenhuisafvalwater aan de vrachten van CPE was variabel en over het algemeen beperkt (<10%), maar kon voor enkele meetmomenten, CPE typen en
ziekenhuizen oplopen tot ongeveer 60%. Een vergelijkbaar beeld werd gevonden voor antibioticaresiduen. Een deel van de gevonden CPE typen stemmen in gepaarde monsters van ziekenhuisafvalwater en RWZI influent overeen wat daarop wijst dat de CPE in RWZI influent van het ziekenhuis afkomstig zouden kunnen zijn, andere typen CPE komen op een meettijdstip alleen in RWZI influent of ziekenhuisafvalwater voor. In conclusie toont het huidige onderzoek daarmee aan dat CPE
dragerschap niet alleen voorkomt in ziekenhuizen maar ook daarbuiten, en dat de relatieve bijdrage per meettijdstip en CPE type varieert. Door aanvullende zuivering van ziekenhuisafvalwater zou de lozing van CPE vanuit ziekenhuizen verminderd kunnen worden. Dit is echter geen methode om de vrachten van CPE substantieel te verlagen, omdat de meerderheid van CPE (behalve dan in enkele metingen) in dit onderzoek niet afkomstig was van het ziekenhuis.
5
Referenties
Albiger, B., Glasner, C., Struelens, M.J., Grundmann, H., Monnet, D.L. and European Survey of Carbapenemase-Producing
Enterobacteriaceae working group (2015) Carbapenemase-
producing Enterobacteriaceae in Europe: assessment by national experts from 38 countries, May 2015. Euro Surveill 20(45). Bell, B., Bell, M., Bowen, A., Braden, C., Brandt, M., Brown, A.,
Burkhardt, A. et al. (2013) Antibiotic resistance threats in the United States, 2013. US Department of Health and Human Services, Center for Disease Control and Prevention.
Bello Gonzalez Tde, J., Zuidema, T., Bor, G., Smidt, H. and van Passel, M.W. (2015) Study of the Aminoglycoside Subsistence Phenotype of Bacteria Residing in the Gut of Humans and Zoo Animals. Front Microbiol 6, 1550.
Berendsen, B.J., Gerritsen, H.W., Wegh, R.S., Lameris, S., van Sebille, R., Stolker, A.A. and Nielen, M.W. (2013) Comprehensive analysis of beta-lactam antibiotics including penicillins, cephalosporins, and carbapenems in poultry muscle using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 405(24), 7859-7874.
Berendsen, B.J., Wegh, R.S., Memelink, J., Zuidema, T. and Stolker, L.A. (2015) The analysis of animal faeces as a tool to monitor antibiotic usage. Talanta 132, 258-268.
CBS (2011) StatLine: Lozing van afvalwater door huishoudens en bedrijven.
http://statline.cbs.nl/StatWeb/publication/?VW=T&DM=SLNL&PA= 70223ned&D1=a,!9-10&D2=0&D3=a&HD=090624-
1001&HDR=G1,G2&STB=T.
Doi, Y. and Paterson, D.L. (2015) Carbapenemase-producing
Enterobacteriaceae. Semin Respir Crit Care Med 36(1), 74-84.
Haverkate, M.R., Platteel, T.N., Fluit, A.C., Cohen Stuart, J.W., Leverstein-van Hall, M.A., Thijsen, S.F.T., Scharringa, J., Kloosterman, R.C., Bonten, M.J.M. and Bootsma, M.C.J. (2017) Quantifying within-household transmission of extended-spectrum beta-lactamase-producing bacteria. Clin Microbiol Infect 23(1), 46 e41-46 e47.
Reuland, E.A., Overdevest, I.T., Al Naiemi, N., Kalpoe, J.S., Rijnsburger, M.C., Raadsen, S.A., Ligtenberg-Burgman, I., van der Zwaluw, K.W., Heck, M., Savelkoul, P.H., Kluytmans, J.A. and
Vandenbroucke-Grauls, C.M. (2013) High prevalence of ESBL- producing Enterobacteriaceae carriage in Dutch community patients with gastrointestinal complaints. Clin Microbiol Infect 19(6), 542-549.
Schmitt, H., Blaak, H., Kemper, M., Van Passel, M., Hierink, F., Van Leuken, J., De Roda Husman, A.M., van der Grinten, E., Rutgers, M., Schijven, J., de Man, H., Hoeksma, P. and Zuidema, T. (2017) Bronnen van antibioticaresistentie in het milieu en mogelijke maatregelen. RIVM rapport 2017-0058.
Tacconelli, E. and Magrini, N. (2017) Global Priority list of antibiotic- resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics.
http://www.who.int/medicines/publications/WHO-PPL- Short_Summary_25Feb-ET_NM_WHO.pdf?ua=1.
Tzouvelekis, L.S., Markogiannakis, A., Piperaki, E., Souli, M. and Daikos, G.L. (2014) Treating infections caused by carbapenemase-
producing Enterobacteriaceae. Clin Microbiol Infect 20(9), 862- 872.
van Hattem, J.M., Arcilla, M.S., Bootsma, M.C., van Genderen, P.J., Goorhuis, A., Grobusch, M.P., Molhoek, N., Oude Lashof, A.M., Schultsz, C., Stobberingh, E.E., Verbrugh, H.A., de Jong, M.D., Melles, D.C. and Penders, J. (2016) Prolonged carriage and potential onward transmission of carbapenemase-producing
Enterobacteriaceae in Dutch travelers. Future Microbiol 11, 857-
864.
van Hoek, A.H., Schouls, L., van Santen, M.G., Florijn, A., de Greeff, S.C. and van Duijkeren, E. (2015) Molecular characteristics of extended-spectrum cephalosporin-resistant Enterobacteriaceae from humans in the community. PLoS One 10(6), e0129085.
6
Annex
6.1 Analyse van antibioticaresiduen
6.1.1 Analysis of tetracyclines, sulfonamides, macrolides and quinolones
Analysis of tetracyclines, sulfonamides, macrolides and quinolones were performed as in Berendsen et al. (2015), with adaptations as
summarized in the following paragraphs:
Sample pre-treatment
Two 40 ml portions of each sample of sewage were weighed into separate 50 mL tubes, after which internal standards were added. To one of these portions antibiotics were added at a level of 25 ng/L for the sulfonamides and 100 ng/L for the tetracyclines, quinolones and
macrolides. Four mL of EDTA-McIlvain buffer (0.1 M, pH 4.0) were added, after which the samples were shaken for 5 minutes head-over- head. The residue was taken up in 100 μL MeOH, after which 400 μL water was added.
LC-MS / MS
The following gradient was applied: 0-0.5 min 1% B; 0.5-2.5 min linear increase to 25% B; 2.5-5.4 min linear increase to 70% B; 5.4-5.5 min linear increase to 100% B, with a final hold of 1.0 min. The injection volume was 5 μL. Detection was carried out by an AB Sciex
(Ramingham, MA, USA) Q-Trap 5500 or a Q-Trap 6500 mass
spectrometer in positive electrospray ionisation (ESI). The parameters used for the Q-Trap 5500 and the Q-Trap 6500 were: capillary voltage, - 4.0 kV; declustering potential, 10 V; source temperature, 450 ° C; GAS 1 and 2, 50 (arbitrary units).
6.1.2 Analysis of aminoglycosides
Analysis of aminoglycosides was performed as in Bello Gonzalez Tde et al. (2015), with adaptations as summarized in the following paragraphs:
Sample pre-treatment
Two 10 ml portions of each sample of sewage were weighed into separate 50 mL tubes, after which internal standards were added. To one of these portions aminoglycosides were added at a level of 50 μg/L. Twenty mL of extraction liquid (10 mM KH2PO4 with 0.4 mM EDTA and 2% TCA) were added, samples were mixed by means of a vortex and shaken head-over-head for 10 min. The extract was then brought to pH 7.6-7.9 and centrifuged (15 min, 3600 g). The complete extract was transferred to a conditioned CBX cartridge, followed by washing with 4 mL of water and drying. The aminoglycosides were eluted with 3 mL acetic acid (10% in MeOH). The eluate was dried at 60°C, evaporated under N2 and taken up in 400 μL HFBA (0.065%).
LC-MS / MS
The following gradient was applied: 0-0.5 min, 0% B; 0.5-5 min, linear increase to 45% B; 5-8 min, linear increase to 60% B; 8-10 min, linear increase to 100% B. The injection volume was 40 μL. Detection was carried out by a Waters (Milford, MA, USA) Quattro Ultima mass
spectrometer in positive electrospray ionization (ESI) mode. The parameters used were: capillary voltage, 2.7 kV; desolvation
temperature, 500 ° C; source temperature, 120 ° C; cone gas, 150 L/h and desolvation gas 550 L/h.
6.1.3 Analysis of β-lactams
Analysis of β-lactams was performed as in Berendsen et al. (2013), with adaptations as summarized in the following paragraphs:
Sample pre-treatment
Two 10 ml portions of each sample of sewage were weighed into separate 50 mL tubes, after which internal standards were added. To one of these portions β-lactams were added at a level of 50 μg/L for the penicillins and 500 μg/L for the cephalosporins and carbapenems.
LC-MS / MS
Detection was carried out by a Waters model Xevo TQS or an AB Sciex (Ramingham, MA, USA) Q-Trap 6500 mass spectrometer in positive electrospray ionization (ESI) mode. The parameters used for the QTrap 6500 were: capillary voltage, 2.0 kV; cone voltage, 25 V; source offset, 20 V; source temperature, 150 ° C; desolvation temperature, 550 ° C; cone gas flow, 150 L/h and desolvation gas, 600 L/h.